水环境有机污染物微生物转化的代谢调控研究

吕 颖

(北京市北运河管理处，北京 101101)

水环境有机污染物主要来源于人类活动，具体包括生活污水、畜禽养殖废水及各类工业废水[1]。污染水环境的主要物质有石油类、农药、表面活性剂以及酚类等化学物质，还有一些腐殖质、多糖类等非挥发性的有机物质，这些污染物在转化降解时会消耗水中的溶解氧，恶化水质，破坏生态平衡[2]。微生物转化过程是通过微生物细胞修复复杂的底物结构，即使用微生物代谢过程中产生的酶，催化底物反应[3]。代谢调控可以打破微生物细胞内的自动调节机制，使其朝着人们所期望的方向发展。研究水环境有机污染物微生物转化的代谢调控，可以更好地监测水环境中的污染物的变化，改善水质[4]。

1 实验材料和方法

1.1 实验有机物及微生物

实验采用居民居住区周围的河流水源，在水源周围设立3个不同的水样采集点(A、B、C点)，采集点A、B、C具体位置见图1。

图1 水样采集点位置

有关研究表明:真菌分裂、生长、孢子萌发都与碳浓度大小有关，在真菌中起着调节传输物质的作用，还会调节氨基酸的传输，不同的微生物体内都有特异代谢方式[5]。实验使用长孢葡萄穗酶，将菌株接种于种子培养液中，培养3天后获得微生物子液，再将甘油与生理盐水调和为4∶6的比例混合均匀，将此时的混合液与微生物子液按照1∶1的比例混合于冻藏管，放在-80℃冷冻室中保存。新鲜的微生物子液放置在斜面培养基上培养3天，获得孢子，然后将获得的孢子置于冷冻真空干燥的环境中保存[6]。

1.2 培养基

使用直径90mm、高15mm、容量13mL×3格的一次性微生物培养皿，为方便对比，培养基配置3种培养基溶液：斜面培养基(PSA培养基)、种子培养基(GSB培养基)以及原始发酵培养基(改良查氏培养基)。

斜面培养基：将土豆去皮，切成薄片取30g，加入70g蒸馏水，煮至土豆松软，使用四层纱布将土豆变为泥状，制成浓度为25g/L的土豆溶液。加入蔗糖15g/L，琼脂20g/L，然后将整个培养基的水分补水至100mL，然后放入微波炉中加热直至琼脂全部溶解的状态，斜面培养基中的溶液制作完毕，将溶液分装到试管中[7]。

种子培养基的具体配置成分见表1。混合表1中的各成分，使用6号成分的盐酸将培养基溶液的pH值调节至6。

表1 种子培养基配置成分浓度

原始发酵培养基的具体配置见表2。混合表2中的各成分，使用11号浓度的盐酸将培养皿溶液的pH值调节至6。

制备好以上3种培养基，全部置于121℃条件下灭菌15min。

表2 原始发酵培养基配置各成分浓度

续表

1.3 原始培养条件

斜面培养条件：将冻库管中的菌液均匀涂布于斜面培养基中，放置霉菌培养箱中，保持培养箱的温度为25℃，培养6天。

种子培养条件：使用接种环在菌种斜面上刮取拇指大小的菌体，接种到种子培养基的500mL锥形瓶中，将锥形瓶放置在25℃、180r/min摇床中培养6天。

发酵培养条件：取2mL种子培养基中的液体，接种到200mL发酵培养基中，将其置于25℃、180r/min摇床中培养6天[8]。

1.4 实验试剂及仪器

实验试剂包括琼脂、蔗糖、磷酸氢二钾、硫酸镁、无水硫化钙、氯化钙、氯化钠、氯化钴、盐酸、葡萄糖、氯化钾、硫酸亚铁、可溶性淀粉、脱脂大豆粉、细菌学蛋白胨、酵母提取物；实际代谢调控时的仪器使用霉菌培养箱[9]。

1.5 调控方法

调控前先将接种方式更改为直接接种孢子的方式，依据转化时间，更换培养条件：将300万个孢子接种于100mL种子培养基的500mL锥形瓶中，接种量为5%，培养26～28h。培养温度均为25℃，转速为180r/min。菌体在培养基内要维持生长需要的足够的碳，摇动发酵液后，此时微生物代谢会进入TCA循环，产生大量的能量供给微生物的生命活动[10]。改变常见碳源的浓度梯度，或改变常见碳源的成分，将碳浓度设定为表3中数值。

使用表3中调控的碳源浓度，设定3种不同梯度碳源浓度，发酵期为6天，使用150mL的锥形瓶，装取75mL混有3种不同浓度的碳源的培养液[11]。计算菌体湿重公式为

(1)

式中：W为菌体湿重；CS为培养基面积；FS为视野面积；Fn为每片计数过的视野数；V为1L水经沉淀浓缩后的体积；v为计数框体积；Pn为每片通过计算实际数出的菌类个数[12]。

菌体干重的计算公式为

(2)

式中：M为菌体干重；x，y为培养基观测位置；t为实验时间；C为(x,y)处t时刻碳浓度；n为pH值大小；Dx为横向弥散系数；Dy为纵向弥散系数[13]。

1.5.1 低碳源

将发酵液摇晃均匀后，取10mL置于布氏漏斗中，同时加入100mL去离子水冲洗，真空抽滤，水分抽滤干后将滤纸置于65℃烘箱中11h,烘干，然后置于干燥器中恒重24h，称重，计算菌体干重。

1.5.2 中碳源

取发酵液750μL于2mL的离心管中，加入750μL发酵液与甲醛1∶1萃取后的溶液，混合均匀后，使用超声波超声提取5min，使用1mL注射器吸取溶液上部分清液，然后使用尺寸为0.45μm的滤头过滤，用高效液相色谱测定菌体的干湿重。

1.5.3 高碳源

高碳源调控方法使用HPLC检测，设定检测条件为Kromasil-C18液相色谱柱，柱温40℃，检测波长为260mm，流速为1mL/min，进样量为20μL，流动相为0.1%三氟乙酸和乙腈线性梯度洗脱。设置洗脱梯度为：0.01～30.00min，45%B相；30.00～35.00min，85%B相[14]。配置不同浓度的标准溶液(10mg/L、25mg/L、55mg/L、95mg/L、125mg/L、225mg/L、325mg/L、425mg/L、525mg/L)，计算得到相峰积分，然后计算各个相峰面积，得到菌体干湿重大小。使用峰面积对碳浓度做标准曲线(回归系数R2=0.99)，标准曲线的公式为

y=16.591x+8.9933

(3)

式中：其中回归系数为R2=0.9998；x为时间，min[15]。

2 调控结果

2.1 低浓度调控结果

不同菌种类型会产生不同的代谢产物，而同一种菌种在产生代谢产物时，对应最佳菌体的重量也不同，调控微生物转化时，控制3种不同浓度的碳源，统计调控6天培养基，得到的低碳浓度的菌体干湿重变化见图2。

图2 低浓度碳源菌体干湿重变化

由图2可知:控制低碳源浓度为0～35000mg/L时，随着时间的增长，菌体湿重稳步增长，在约126h时，湿重开始减小，最终维持在38～40g之间。菌体在78h时，干重开始下降，但在90h时，又恢复稳固上升的趋势。

2.2 中浓度调控结果

维持中浓度碳源在7000～42000mg/L，随着水分的蒸发，前几个小时菌体生长旺盛，菌液黏稠。将通气调至最高，补加水增强控制菌的摄氧率，增强有机污染物微生物转化代谢过程。中浓度碳源菌体干湿重变化见图3。

图3 中浓度碳源菌体干湿重变化

由图3可知:维持中浓度碳源，在96h时，菌体湿重大小发生小转折，但依旧保持上升趋势；而此时的菌体干重并没有发生明显变化，最终维持在10g左右。

2.3 高浓度调控结果

增加碳源种类，将碳源浓度保持在21000～56000mg/L的高浓度区间内，菌体在此浓度下，自体产生自行代谢，并产生大量的前体，此时的菌体干湿重量变化见图4。

图4 高浓度碳源菌体干湿重变化

由图4可知:维持高浓度碳源，菌体在20h时，湿重逐渐增加，大小增长到40g。而干重保持增长，到120h时，干重大小变为20g，之后干重减小，实验完毕后，菌体干重维持在10g左右。

3 结 论

3.1 保持低碳浓度环境

在培养基发酵后期，菌体生长缓慢，残糖量较低。维持正常代谢过程时需要足够的碳骨架，碳骨架会产生代谢过程的关键中间体FGFC3，但在低碳浓度环境下的合成能力较低，所以代谢过程在72h时，FGFC3开始积累，才可以维持正常的代谢过程，调控方式基本奏效。在124h之后，由于残糖量过低，培养基发酵液环境内的pH值迅速升高，导致代谢所需的FGFC3无法正常产生，破坏了发酵体系。此时的菌体湿重、干重波动较大，调控效果最明显。

3.2 保持中浓度碳环境

在20h时，逐渐产生FGFC3，没有出现二次积累，并随着时间的持续积累呈现出一种小幅度的波动变化。中碳浓度的调控环境，可以提供足够的碳骨架，帮助产生更多的FGFC3。但剩下的中浓度碳源会在一段时间内，打破代谢平衡。随着时间的增加，代谢会产生一种由正常代谢到打破正常代谢，最终又恢复正常代谢的循环过程，导致图2中湿重不断增加、干重基本保持不变的情况。调控效果不明显，基本不影响水环境有机污染物微生物的转化。

3.3 调节到高浓度碳环境

代谢过程中的酶会将鸟氨酸转化为瓜氨酸，瓜氨酸参与到代谢过程中反应，转换形成精氨琥珀酸，然后在酶的催化下，裂解水解后形成尿素，加快了代谢过程。所以在72h之后，残糖量低，高浓度的碳源会合成更多的FGFC3，剩余的碳源会因为浓度过高，经干燥后增加了菌体的干重。在120h时，经过干燥后的碳会变成区别于菌体的黑色固体，去除残余的黑色碳，得到菌体干重大小变化。因此,高浓度调控环境，代谢调控效果一般。

4 结 语

在当今蓬勃发展的社会，疏忽对环境的保护，会造成环境的污染。研究水环境有机污染物微生物转化的代谢调控，可以更科学地治理被有机污染物污染的水环境，更加全面地研究水环境内存在的有机污染物，有助于水环境的治理，使经济发展与环境发展相协调，实现可持续发展。