揭秘!核酸检测大法是如何进行的

南枝

2019年12月以来，我国湖北省武汉市陆续发现多例新型冠状病毒性肺炎患者，随着疫情蔓延，我国其他地区及境外也相继发现了这一类病例。该病为急性呼吸道传染病，已纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病。

新型冠状病毒性肺炎诊疗方案里，对新型冠状病毒性肺炎的病原学确诊，需要具备病原学证据。

对病原学证据的确定，主要包括两个方法，一是通过实时荧光RT-PCR检測新型冠状病毒核酸阳性，二是病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源。国内主要使用的是第一种，通过实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸，这一方法不仅快速而且准确率高。

那么，通过实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒，原理到底是什么，具体又是怎么操作的呢？

新型冠状病毒病原学特点

冠状病毒为单股正链RNA病毒，属于套式病毒目（Nidovirales）冠状病毒科（Coronavirdae）正冠状病毒亚科（Orthocoronavirinae），分为α、β、γ和δ四个属。

2019新型冠状病毒（2019 Novel Coronavirus，2019-nCoV）正好属于冠状病毒的β属，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARS-CoY和MERS-CoV有明显区別。目前，研究显示与蝙蝠SARS样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45）同源性达85%以上。

病毒，是自然界最简单的生命形式。它的组成成分非常简单，最基本的构成是遗传物质（DNA或者RNA）和蛋白质，有时也会存在糖类与脂质组成的包膜。每种生物的遗传物质都有和其他物种不一样的地方，这是鉴定一种物种最准确的方法。

新冠病毒的遗传物质为RNA，它的RNA中的特异性序列可以用于区分该病毒与包括其他病原在内的物种。这是通过检测核酸序列来检测新冠病毒的基础。

鉴定的主要方法是完成对新型冠状病毒全基因组测序，并将其基因组序列与其他物种的基因组序列进行比对，找到新冠病毒中的特异核酸序列。这些特异核酸序列是新冠病毒必须含有，又和其他物种存在不一样的部分。只要找到它们，就可以证明存在新冠病毒，且只是新冠病毒，而不是其他的东西。

现如今，使用的新冠病毒的特异性序列便包括新冠病毒基因组中的ORF1ab、N、S、E区。国内检测新冠病毒用得最多的则是ORF1ab和N区。

如何检测新冠病毒的特异性序列

我们通过研究找到了新冠病毒的特异性序列，那要怎么将它们从患者的样本里检测出来呢？

主要步骤包括：

1.获得患者的样本（咽拭子、鼻拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液、粪便、肛拭子等）

2.从患者的样本中提取病毒RNA

3.将病毒RNA进行荧光定量PCR

原理是以新冠病毒特异性的基因序列为检测靶标，通过PCR扩增，使我们选择的这段靶标DNA序列指数级增加，每一个扩增出来的DNA序列，都可以和我们预先加入的一段特定的荧光标记探针结合，产生荧光信号。扩增出来的靶基因越多，累积的荧光信号就越强，通过监测荧光信号可以确定样本中是否有病毒核酸。

经过以上荧光定量PCR后，在实验室要确认一个病例为新冠病毒阳性，需要满足以下条件：同一份标本中新型冠状病毒2个靶标（ORF1ab、N）特异性实时荧光RT-PCR检测结果均为阳性。如果出现单个靶标阳性的检测结果，则需要重新采样，重新检测。这用于保证结果的准确性。

至此，新型冠状病毒核酸检测全过程就完成了。

PCP（Polymerase Chain Reaction.聚合酶链式反应）是一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术。通过将特定模板双链DNA要性解链成单链，再将扩增物和模板DNA互补结合，再在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反应原料，靶序列为模板，按照碱基互补配对原则，进行半保留复制，合成一条新的DNA。新的DNA再变性解链成单链，如此，进行循环，每个循环大约用1-3分钟，这样，在短短1-2个小的内就能将目的基因扩增放大几百万倍。

因PCR的反应模板只能是DNA，而新冠病毒核酸是单链RNA，所以，在PCR之前，需要先将新冠病毒核酸（单链RNA）逆转录为DNA，再进行PCR。

荧光定量PCR，则是在PCR反应体系中，在包含一对特异性引物外，还有一个Tagman探针，该探针为一段PCR扩增序列中的特异陸寡核苷酸序列，它的两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，不发光;如反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针酶切降解，报告基团与淬灭基团分离，便会发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监測荧光信号以及荧光到达预先设定阈值的循环数（Ct值）。该循环数（Ct值）与病毒核酸浓度有关，病毒核酸浓度越高，循环数（Ct值）值越小。不同生产企业的产品会依据自身产品的性能确定本产品的循环数（Ct值）阳性判断值。