结直肠腺癌侵袭性前缘的生长方式及肿瘤细胞巢出芽和CD8+T淋巴细胞浸润与其临床病理学特征的关系*

在全球，结直肠癌在全部癌症中发病率居第3位，死亡率居第4位［1］。由于结直肠癌的临床结局差异较大，大量研究着力于探索预测其侵袭性的组织学特征，以便对广大患者进行密切监测和积极治疗。肿瘤侵袭性前缘可能代表肿瘤细胞播散到淋巴管和血管的最具有侵袭性的危险区域。本研究观察结直肠腺癌侵袭性前缘的生长方式，肿瘤细胞出芽的数量和CD8+T淋巴细胞浸润的数量，并探讨以上参数与相关临床病理学特征的关系。

1 材料和方法

1.1 病例资料

收集2008年1月至2019年12月在河西学院附属张掖人民医院行手术切除的126例原发性结直肠腺癌患者的石蜡包埋样本，其中男性71例、女性55例；年龄35～87岁；结肠癌52例、直肠癌74例；临床分期Ⅰ期18例、Ⅱ期67例、Ⅲ期41例。所有患者均未接受过新辅助化疗和放疗。

1.2 方法

1.2.1 形态学评估 所有样本的组织学分型和肿瘤分级依据美国癌症联合委员会（AJCC）第8版指南进行［2］。肿瘤的肿瘤大小病理分期（pT），淋巴结转移病理分期（pN）和病理分期（pStage）根据目前的TNM 分类系统分类。患者的临床病理学特征见表1。

表1 患者的临床病理学特征

1.2.2 免疫组织化学法检测 组织切片（4 μm）取自福尔马林固定、石蜡包埋的126例结直肠癌组织。所有切片经脱蜡和梯度酒精脱水。3%H2O2常温孵育10 min去除内源性过氧化物酶，95℃30 min高压锅抗原修复，PBS清洗。切片加广谱CK抗体，CD8抗体（1:200），购自北京中杉金桥生物技术有限公司）。加PBS作为阴性对照，4℃孵育过夜。PBS清洗3次，加二抗（1:100），购自北京中杉金桥生物技术有限公司，37℃孵育45 min，PBS清洗，DAB显色，苏木素复染。

1.2.3 肿瘤侵袭性前缘的组织学评估 肿瘤侵袭性前缘的生长方式，组织学上可分为推挤性和浸润性［3］。浸润性前缘指出现一个或多个下列组织学形态：黏膜肌层流水样分割、脂肪组织中见小腺体、不规则细胞簇和细胞索或神经周围侵犯。无上述形态学表现的为推挤性边缘（图1A，B）。

1.2.4 肿瘤细胞巢出芽的评估 肿瘤细胞巢出芽定义为结直肠癌侵袭性前缘单个癌细胞或＜5个癌细胞的细胞簇［4］。低倍镜下检查整个组织块，选择肿瘤前缘最有代表性的、出芽灶最明显的区域［5-6］，计数10HPFs（×40）出芽灶的数量，取其平均值用于分析［6］。依据肿瘤前缘出芽灶的数量进一步分为低级别（平均值≤10）和高级别（平均值＞10）［6］。出芽灶的计数均在广谱CK 免疫组织化学染色后的切片中进行（图1A）。本组病例中，肿瘤前缘为推挤性生长的均未出现肿瘤细胞巢出芽。

1.2.5 CD8+T 淋巴细胞的评估 选择与评估肿瘤细胞巢出芽灶相同的区域计数10HPFs（×40）CD8+T 淋巴细胞的数量，取其平均值用于分析。依据CD8+T淋巴细胞的数量进一步分为低级别（平均值≤40）和高级别（平均值＞40）［7］。CD8+T淋巴细胞的计数均在免疫组织化学染色后的切片中进行（图1C，D）。

1.3 统计学分析

采用SPSS16.0软件进行统计学分析。χ2检验分析肿瘤侵袭性前缘组织生长方式，肿瘤细胞巢出芽灶数量和CD8+T淋巴细胞数量与临床病理学参数之间的关系。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤侵袭性前缘的组织学特征

依据上述评估标准，本组病例中111例肿瘤前缘呈浸润性生长，15例为推挤性生长。出现小灶性浸润性生长也归入浸润性前缘。结直肠癌侵袭性前缘的浸润性生长方式与pT（P＜0.001）、pN（P=0.023）及脉管浸润有关（P＜0.001），而与患者性别、组织学亚型及分化程度无关（表2）。

2.2 肿瘤细胞巢出芽

本组病例中，肿瘤前缘为推挤性生长的均未出现肿瘤细胞巢出芽。另有4例不符合肿瘤细胞巢出芽的评判标准，因此对其余107例进行肿瘤细胞巢出芽的评估并分组，其中高级别肿瘤细胞巢出芽为35例，低级别为72例。进一步分析表明高级别肿瘤细胞出芽与pT（P=0.029）、pN（P＜0.001）、脉管浸润（P＜0.001）及肿瘤组织学低分化程度密切相关（P＜0.001），而与患者性别、组织学亚型无关（表2）。

2.3 CD8+T淋巴细胞

高级别CD8+T 淋巴细胞浸润可能与阻碍肿瘤细胞淋巴结转移有关（P=0.050），与患者的其他临床病理学特征均无关（表2）。

图1 肿瘤组织免疫组织化学染色表达

表2 肿瘤组织前缘肿瘤细胞巢出芽数和CD8+T细胞数及前缘生长方式与临床病理学特征的关系

3 讨论

近年来结直肠癌发病率呈上升趋势，虽然对结直肠癌的治疗取得了很大进展，但某些方面仍存争议，如Ⅱ期结直肠癌患者是否需要进行辅助治疗。识别Ⅱ期结直肠癌患者中的高危型预后不良患者，使这些患者最大程度从辅助治疗中获益具有重要意义。

结直肠癌有明确的预后因素，如淋巴血管和神经周围的侵袭等［8］。Zlobec等［9］的研究表明肿瘤前缘浸润性生长和推挤性生长的Ⅱ期患者5年生存率分别为62.7%和80.0%。ⅢA 期患者从23.0%提高至83.3%，并且不依赖于术后治疗。本研究分析了126例结直肠癌患者，其中大部分肿瘤前缘为浸润性生长方式，表明浸润性生长方式与肌层浸润、淋巴结转移及脉管浸润显著相关，即与TNM 分期系统密切相关。另外，肿瘤浸润性或推挤性边缘在低倍镜下容易辨别，且具有很好的可重复性，因此肿瘤前缘的生长方式可作为评判预后的一个组织学指征。

在结直肠癌的侵袭性前缘，可见肿瘤侵入结肠周围脂肪组织，并被分隔成细胞簇或单个肿瘤细胞即肿瘤细胞巢出芽，反映了肿瘤的进展侵袭性［10］。研究报道，无肿瘤细胞巢出芽的Ⅲ期患者的5年无病生存率为62.1%，而出现肿瘤细胞巢出芽特征时5年无病生存率仅为35.1%［11］。高级别肿瘤细胞巢出芽与肿瘤预后密切相关，提示患者预后较差［10］，Karamitopoulou等［6］的研究表明伴有高级别肿瘤细胞巢出芽的Ⅱ期结直肠癌患者的死亡危险性为低级别肿瘤细胞巢出芽患者的3.5 倍。为增加肿瘤细胞巢出芽计数的准确性，本研究使用免疫组织化学方法对切片进行广谱CK染色后评估，极大地提高了出芽灶的辨认。本研究显示高级别肿瘤细胞出芽与肌层浸润、淋巴结转移、脉管浸润及肿瘤组织学低分化程度显著相关，与其他研究一致［12-13］。

在肿瘤发展进程中，机体通常会建立抗“肿瘤”细胞毒性炎性反应来延缓肿瘤的进展速度。在多数结直肠癌的发展过程中，淋巴细胞浸润主要由CD4+或CD8+的T 淋巴细胞组成，两种细胞类型均显著增加。多项研究表明，肿瘤间质内浸润的淋巴细胞和沿侵袭性前缘围绕肿瘤浸润的淋巴细胞与总体及特异性生存率具有显著性相关［14-15］。有研究表明肿瘤浸润性淋巴细胞的类型是决定预后的关键因素，而浸润性淋巴细胞的数量与预后关系不大［16］。CD8+T淋巴细胞是免疫监视的重要参与者。本研究分析了结直肠癌肿瘤侵袭性前缘特别是肿瘤细胞巢出芽灶周围的CD8+T淋巴细胞的数量，结果发现可能仅与淋巴结转移有关。有研究表明结直肠癌侵袭性前缘CD8+T淋巴细胞浸润的程度与患者生存无显著性相关［17］。推测可能是其他因素（如浸润性调节性CD4+T淋巴细胞）损伤了CD8+T淋巴细胞防御恶性肿瘤细胞的能力。

综上所述，本研究表明结直肠癌侵袭性前缘的生长方式、肿瘤细胞巢出芽与患者预后相关，这两种组织学形态特征易于诊断，可重复性好，可作为判断患者预后的指征。