原花青素生理功能及其与肠道微生物相互作用的研究进展

扶晓菲,鄢明辉,游春苹

(光明乳业股份有限公司乳业研究院,上海乳业生物工程技术研究中心,乳业生物技术国家重点实验室,上海 200436)

原花青素(proanthocyanidins,PACs)又被称作浓缩单宁或浓缩鞣质,是食物中较为常见的一大类类黄酮化合物,具有植物化学活性[1]。PACs主要由儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素等单体(黄烷-3-醇)聚合而成,一般根据单体的聚合度(DP)分为低聚原花青素(oligomeric proanthocyanidins,OPC,PD=2～10)和原花青素高聚体(proanthocyanidins polymers,PPC,PD>10)两大类,依据聚合度也可将其分为游离态PACs和结合态PACs,其中原花青素二聚体作为一种游离态多酚,凭借其良好的水溶性,易被人体吸收而被广泛研究[2]。水果(苹果、葡萄、蔓越莓等)、蔬菜、种子、果皮、坚果、茶叶、红酒等食品提供可观的膳食来源PACs,在人类膳食结构中举足轻重。PACs作为高效天然抗氧化剂的同时,兼有抗菌抗炎、抗肿瘤、预防心血管疾病及其代谢综合征等作用[3-4]。

受现有的分离提取手段的局限,首先PACs的提取技术的开发与优化仍然是研究的重点与难点,其次极少数的游离态PACs虽可经胃和小肠直接吸收,但大量结合态的PACs却在胃和小肠中表现出较低的生物利用度,需要到达结肠经由肠道微生物解离、水解生成游离的PACs才可发挥生理作用[5-7]。研究指出,消化道是食源性PACs促进人体健康作用的关键靶器官,聚合度较高的PACs会到达结肠腔内,经肠道微生物代谢成相应单体及芳香酸等营养物质被小肠、心脏、肝脏等组织利用,此外PACs还充当着益生元的作用,对乳酸菌、双歧杆菌、产丁酸盐细菌等肠道微生物的生长起促进作用,二者间的双向调控既提高了PACs的生物利用率又有助于肠道有益菌的生长。

目前关于二者相互作用的研究较为少见,但不可否认该研究具有深远的应用价值[6,8-10]。一方面,基于PACs作为高生物活性的膳食多酚重要来源这一事实,本课题的研究对于进一步解决PACs低吸收率问题及扩大PACs的广泛应用而言十分必要;另一方面该研究也探究了肠道微生物对包括PACs在内的膳食多酚的重要作用,丰富了肠道微生物的研究领域。本综述通过比较PACs与花青素的异同点来归纳PACs的生理活性、综述其与肠道微生物相互作用,试图为该作用在诸多慢性疾病中发挥的潜在作用研究提供理论参考,一定程度上也是对饮食疗法的补充和总结。

1 原花青素与花青素

PACs和花青素不尽相同,实际上PACs是花青素的前体,因此也被称作前花青素,经由MYB转录因子互作等途径生成花青素[11]。PACs和花青素同属类黄酮类植物化合物,都是食源性的天然抗氧化剂,但也可从化学结构、颜色及分布、代谢方式、应用途径差异等几个方面来加以区分[1,12]。

从化学结构来看,PACs是由不同种类及数量的以2-苯基色原酮为母核,经衍生形成的单体结构(也即黄烷-3-醇),借助各单体间不同形式的C—C键(或兼含C—C键和C—O—C键)聚合而成的一大类不同聚合度、不同空间构型、可被酯化、甲基化的多酚类物质。花青素则是以2-苯基色原烯为母核衍生而得的类黄酮化合物存在,极少以游离形式存在,常借助糖苷键与糖形成花色苷并存在于植物中[4,12-13]。常见PACs二聚体和花青素的一般化学结构见图1。PACs自身多呈无色至棕色,参与植物种皮、果皮等的着色,多使之呈现褐色,而花青素作为一种水溶性色素,使得黑枸杞、黑莓、葡萄、草莓等植物呈现丰富的颜色,如蓝色、紫色、红色、粉色等,并在不同的环境中出现颜色蓝移或红移的情况[14]。花青素的主要代谢场所是胃和小肠,最终以花青素或其代谢物的形式排出体外,OPC遵从同样的代谢途径,而PPC一般经结肠经微生物分解代谢后输送至其他组织[8,12]。此外,二者的应用领域不一致,PACs目前主要应用在药品、保健品、食品防腐剂等方面,而花青素基于天然色素和抗氧化性这两个特性,在保健品、化妆品、食品添加剂等领域有所应用[12]。

图1 原花青素和花青素的常见化学结构Fig.1 Common chemical structures ofproanthocyanidins and anthocyanins

2 原花青素的主要生理功能

2.1 抗氧化作用

抗氧化及清除自由基是PACs等膳食多酚最显著的的生理特性,既有文献表示可可、葡萄籽副产品、脂溶性葡萄籽PACs(grape seed proanthocyanidins,GSP)等提供了大量的PACs,可与生物体内其他分子相互作用而产生抗氧化、抗炎等功效,有望成为新型抗氧化剂[15-16]。PACs抗氧化应激的研究,也历经了从作用机制上升至临床应用的过程,通常认为PACs通过减少DNA损伤、丝裂原活化蛋白激酶、脂质过氧化作用及增加Nrf2转录因子,调控其他途径而达到防控心血管疾病、神经退行性疾病、代谢性疾病、皮肤病、癌症的目的[3]。紫外线(ultraviolet light,UV)是一项重要危险因素,它会引起DNA损伤、引发免疫抑制,进而导致皮肤癌,研究指出富含PACs和绿茶多酚等的膳食制剂,可修复DNA损伤并介导UV诱导的免疫抑制过程,从而具有抗辐射及光保护作用[17]。对于d-半乳糖诱导的衰老模型小鼠,Xiao等[18]借助水迷宫和空间记忆测试,血浆代谢组学分析,辅以肠道微生物群检测等综合性手段,得出长达7周的PACs治疗可通过调节机体代谢途径来预防小鼠认知下降及氧化损伤的结论。中枢神经系统损伤引起的脑水肿同样是诱发疾病乃至致死的重要危险因素,一项将30只雄性大鼠分别分为对照组、创伤组和治疗组的动物实验,实验组经颅骨切除和冷损伤后检测脑含水量,结果证实PACs可以有效减少实验性创伤后的氧化应激,具有抗脑水肿作用[19]。

2.2 抗菌抗炎作用

PACs的另一个典型特征是抗炎杀菌,凭借较好的抗粘附特性在减轻水肿,防治类风湿性关节炎、尿路感染(urinary tract infection,UTI)、胃粘膜感染、口腔感染,预防类抑郁行为等中体现出潜在价值[20]。类风湿性关节炎是一种引发机体软骨、骨骼、滑膜等组织产生慢性周身性炎症,引起多器官损伤,进而慢性致残的疾病,常规药物治疗效果欠佳且价格昂贵、副作用明显,一项近期研究成果提出,源于墨西哥雨林灌木的富含PPC的提取物,经作用于CD-1雌性小鼠9 d,发现PPC介导了白细胞介素(Interleukin,IL)-1β、IL-17和IL-6浓度的降低和肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)的减少,同时测得小鼠的炎症抑制率高达72%,表现出了PPC良好的抗炎特性[21]。蔓越莓PACs(Cranberry proanthocyanidins,c-PAC)应用于缓解男性睾丸外感染症状、预防女性的复发性UTI有着几十年的历史,既有报道认为c-PAC这一生物活性发挥可能多依赖其特有的“A型”黄烷键。美国一项相关研究对具有复发性UTI病史的182名妇女随机分组,实验组持续6个月每日服用500 mg的全蔓越莓果粉(PACs含量为0.56%),在发现各组的生化参数无基本差别的基础上,UTI复发率较对照组(25.8%)显著减少,只有10.8%,表现出了PACs降低复发性UTI的巨大潜力[22-23]。此外,PACs抗炎抗氧化功能的应用也拓展了到其他方面,有报道指出神经炎症和细胞因子水平的升高与抑郁症之间存在相关性,PACs可以通过强效的抗炎作用来抑制脂多糖诱导的小鼠类抑郁行为,有望成为潜在有效治疗剂[24]。

2.3 抗肿瘤作用

近年来PACs的潜在抗肿瘤作用也成为了研究热点。借助上调NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)来介导氧化应激过程,进而增加非小细胞肺癌细胞的迁移,是吸烟致癌的关键机制,GSP对腺癌人类肺泡基底上皮细胞(A549)的体外实验结果显示,GSP借助影响NOX关键组分的蛋白水平介导氧化应激,借助减少上皮间质转化控制了香烟烟雾冷凝物诱导的细胞迁移,具有潜在的预防及治疗肺癌的作用[25]。肝细胞癌也是一种常见肝癌类型,前期症状不明显且术后5年生存率不高,影响人类生活健康。血管生成拟态(vasculogenic mimicry,VM)是一种新型血液供应模式,其潜在机制有望为肝癌治疗的潜在靶点,一项以不同剂量的GSP分组作用于H22肝癌模型小鼠的研究表示,GSP以剂量依赖的方式有效抑制了VM结构,可能成为有效的抗VM药物[26]。近年来食管癌的发生率呈上升趋势,术后5年生存率同样不容乐观,其中胆汁和胃酸回流是食管癌的重要诱因。研究指出c-PAC对食管癌潜在治疗机制包括激活自噬机制和抑制胆汁酸代谢等,这一机制同时起到了逆转肠道微生物失调的作用[27]。Toden等[28]借助系统性的体外内等实验证实了OPC对结直肠癌的保护作用,同时提出了一种新型结肠癌预防机制,包括降低LGR5、CD44和CD133在内的肠癌干细胞标志物的表达,下调关键转录因子YAP、TAZ等实现干扰癌细胞发育和自我更新。马尾松皮中提取的PACs(Pinus massoniana Bark proanthocyanidins,PMBPs)和GSP被证明分别对卵巢癌[29]和宫颈癌[30]发挥积极作用,且保护机制高度一致,即借助线粒体相关凋亡通路的激活发挥作用,详细作用机制包括线粒体膜电位的丢失、抗凋亡蛋白Bcl-2的下调及Caspase 3、Caspase 9等抗体的活化。PACs的主要生理功能及常见应用见表1。

表1 PACs的主要生理功能及其应用Table 1 Major physiological functions and application of PACs

2.4 防控心血管疾病及代谢综合征

PACs作为一种膳食生物活性物质,在诸多常见慢性疾病的调节中发挥着特定的生理功能。既有报道推荐摄入PACs等黄烷醇化合物,认为其既降低了健康危险因素,又具有防治心血管疾病和延缓衰老的保护作用,PACs的生物活性与人体营养和健康之间的广泛相关性值得进一步探究[31]。Lee等[32]指出,PACs的A2型(PA2)代谢物具有较好的预防动脉粥样硬化的潜力,其潜在作用机制可以概括为PACs的主要微生物代谢物5-(3′,4′-二羟基苯基-γ戊内酯)(DHPV),较PACs或其单体具有更好的防治效果,多借助下调导致动脉粥样硬化的生物标志物如血管细胞粘附分子等,减少TNF在血管细胞上的粘附而发挥保护作用。临床数据显示PACs对葡萄糖稳态起调节作用,较高剂量的PACs摄入被报道与糖尿病风险的降低相关[33]。一项针对高脂肪饮食诱导的糖尿病大鼠的研究指出,服用16周500 mg/kg剂量的GSP大鼠,其坐骨神经游离钙离子浓度显著降低,同时Ca(2+)-ATP酶活性有所提高,提示了GSP具有预防大鼠周围神经的早期功能和形态学异常的作用[34]。Wang等[35]归纳了PACs防治2型糖尿病及其并发症如高脂血症和调节肠道菌群的机制,包括葡萄糖吸收的促进、脂质分解的抑制及胰岛素稳态的调节等。一种较为公认的预防糖尿病、肥胖等慢性疾病的策略是抑制目标消化酶,低聚合度PACs是一种很好的消化酶抑制剂,具有预防肥胖及减重的可能[2]。研究发现[36],与喂食普通饲料相比,经高脂肪胆固醇饮食喂食的家兔体重、胰岛素抵抗、肝指数等指标相对较高,用PACs的B2型(PB2)治疗12周后,经处死检测其血清生物标志物并评估其肝脏的组织学参数表明,PB2治疗有效防止了因高脂肪胆固醇饮食引起的体重增加、高甘油三酯血症、肝脏甘油三酯积累。高血压病理生理学的一个重要生理指标是心血管重构,经GSP治疗的DOCA盐诱导的SD大鼠,血管调节因子内皮素-1(endothelin-1,ET-1)释放减少,证实了GSP通过抑制活性氧/丝裂原活化蛋白激酶通路,进而对由心血管重塑引起的血压升高产生保护作用[37]。另外一种潜在机制认为,País葡萄来源的PACs具有抑制血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)的作用,提示了其作为天然抑制剂的潜在机制[38]。此外,OPC也被报道改善了小鼠心血管重塑指数和氧化应激状态,在孕鼠高血压的防治中发挥较好的疗效,为临床应用提供了治疗方向[39]。

2.5 其他作用

Choi等[40]还报道了PACs借助抑制肥大细胞的活化机制介导了小鼠的过敏反应。除此之外,PACs作为一种强效自由基清除剂,可通过抑制氧化应激对常见化疗药物阿霉素造成的肾脏毒性发挥保护作用[41],同时也使得暴露于由结肠微生物群产生的甲酚的结肠上皮细胞,细胞活力得到改善,免受甲酚的损害[3]。PACs的主要生理功能及其应用见表1。

3 原花青素与肠道微生物的相互作用

3.1 肠道微生物对原花青素的积极影响

PACs与肠道微生物相互作用的研究尚不多见,一般认为,PACs生物利用率的提高及应用范围的扩大,离不开消化道中肠道微生物作用下的代谢途径的加快及抗氧化应激能力的提高,一定程度上PACs的吸收与代谢依赖于人类消化的微生物种群变化[42]。人肠道微生物具有将PA2、PB2、c-PAC分解代谢成苯甲酸、2-苯乙酸、3-苯丙酸等多酚化合物的能力,这些微生物代谢物对PACs生物活性的提高具有促进作用,既对PACs的生物利用度的改善做出了贡献,又为其在人类健康中的应用提供了新视角[43-44]。

经由肠道微生物代谢的PACs在免疫力下降、衰老、记忆障碍、胃炎、动脉粥样硬化等症状及疾病中都体现出保护潜力。PACs预防衰老作用机制的研究指出PB2在改善小鼠氧化损伤的同时伴随着厚壁菌门/拟杆菌门比值、双歧杆菌丰度的显著变化,肠道菌群的重塑提示了机体代谢途径的调节可能介导了抗衰老过程[18]。莲蓬PACs(LSPC)已被报道具有增加记忆的作用,研究指出乳酸菌(Lactobacilluscasei-01,LC)分别与低、高剂量LSPC组合作用于模型小鼠20 d后,借助Y-迷宫测试评估小鼠的学习和记忆能力,得出高剂量实验组(H-LSPC与LC组合作用)的测试错误率分别较对照组(H-LSPC组、LC组)减少了41.59%和68.75%,LSPC和LC的组合通过提高总抗氧化能力水平等增强了LSPC的生理活性,从而达到改善学习记忆障碍、促进记忆增强的目的,肠功能也被报道借助上述双向作用而得到调节[45]。近期相关研究也指出PACs在抗炎有了新应用,由于调节胃上皮IL-8是减轻胃炎及预防其恶化的有效手段,实验发现分离自板栗的PACs可以借助破坏NF-κB信号传导和其他机制来抑制IL-8的分泌,这一实验结果为潜在抗胃炎类营养保健品的开发提供了生物指导思路[46]。此外,益生菌如鼠李乳杆菌促进了c-PAC的生物转化和代谢,其代谢产物4-羟基苯乙酸、水肉桂酸等也显示出增强肝癌HepG2细胞的体外抗癌活性,有助于PACs更好的发挥药理活性[47]。

3.2 原花青素对肠道微生物的积极影响

PACs对肠道微生物的影响主要通过增加微生物多样性、调节肠道稳态、提高氧化应激能力等来体现,其作用机制尚不完全明确,总体表现为通过增强双歧杆菌、乳酸菌、阿克曼菌(AKK)等益生菌,并抑制部分肠道有害菌群来改善肠道菌群、增强肠道屏障功能和维护结肠健康。已知PACs饮食干预与抗生素喂养干预具有差异性,实验发现与仅用抗生素干预的饮食组相比,经PACs和抗生素先后分别喂养巴马小型猪各1个月,借助16S rRNA测序发现,猪肠道微生物群丰富度指标(Chao 1)上升,而螺旋菌属和纤维杆菌门要明显较抗生素组低,提示其作为替代抗生素的潜在可能性[48]。Han等[49]肯定了GSP作为潜在抗生素替代物的价值,并指出GSP通过作用于肠道微生物,提高了断奶仔猪抵抗肠道氧化应激而发挥改善黏膜屏障的作用。一项关于葡萄籽PACs复合提取物(GSPE)作用于雌性大鼠的研究,既观察到肠道中厚壁菌门/拟杆菌门比例的下降,也发现与饱腹感相关的肠激素如血浆胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的显著增加,大鼠在饱腹感保持不变的前提下,能量消耗增加、食欲减少,提示了PACs对肠道菌群的作用也可能介导其生理作用,改善葡萄糖耐受性进而起到预防糖尿病和肥胖的作用[50]。

同样,PACs对肠道微生物作用的应用主要体现在降低炎症反应、保护心脏代谢、改善肥胖及糖尿病等代谢代谢综合征中。例如,基因工程改良苹果中提取的PACs作用于健康小鼠后,实验组中观察到炎症标志物PGE2、Il2rb、Ccr2、Cxcl10和Ccr10的显著降低,同时总细菌数较对照组提升6%,表现了PACs通过调节肠道微生物群来介导全身抗炎作用[51]。其次,Blumberg等[52]综合蔓越莓相关研究进展指出,c-PAC与其他蔓越莓成分和肠道微生物群之间的具有协同作用,这一作用不仅体现在c-PAC的抗炎功能方面,也表现在调节血脂、血压、内皮功能、血糖等,为蔓越莓对心脏代谢健康产生的良好效果供了更多的证据。在GSPE调节高脂饮食诱导的小鼠体内实验中,16S rDNA分析结果表明,GSPE的补充调节了肠道微生物群组成,同时显著降低TNF-α、IL-6等炎症因子的血浆水平,进而改善了胰岛素敏感性,其作为潜在益生元剂能够靶向肠道微生物菌群,为代谢紊乱的预防和治疗提供可能性[53]。以上类似结论也在绝经模型小鼠实验中被证实,表明GSPE成为预防肥胖、改善绝经后妇女生理失调的潜在功能性食品[54]。总而言之,PACs与肠道微生物具有积极的双向调节作用,并在诸多常见慢性疾病的防控已有所体现。

3.3 原花青素对肠道有害菌的抑制作用

报道也指出,PACs对肠道微生物的调控作用也表现在对沙门氏菌、假单胞菌、奇异变形杆菌、致病性大肠杆菌等肠道有害菌、食源性致病菌等的生长抑制。分离得到的涩柿PACs八聚体,经作用于沙门氏菌并研究其毒力分泌系统发现,PACs不影响细胞的生长,但对抑制致病性毒力蛋白 SPI1的分泌产生抑制作用,表现出良好的抗菌潜力[55]。PACs对阪崎克罗诺杆菌的抑菌作用尚不明确,Joshi等[56]借助蓝莓PACs与等体积的阪崎肠杆菌混合培养0.5、1.0和6.0 h,1 h后测得,实验组菌株减至不可检测水平,同时结合对照组的扫描电镜研结果发现,经处理菌株的细胞膜形态方面存在差异,表明蓝莓PACs对阪崎克罗诺杆菌感染存在预防和治疗潜力。尿路感染通常与生物膜的形成直接相关,一项综合结晶紫生物膜染色、重氮素代谢测定、共聚焦成和质谱分析等技术来检测PACs破坏铜绿假单胞菌生物膜形成的能力的研究指出,c-PAC降低了铜绿假单胞菌的群集运动,且在蛋白表达方面呈现显著差异,具有抗铜绿假单胞菌的生物膜特性的可能性[57]。基于绝大部分尿路感染由致病性大肠杆菌(UPEC)和奇异变形杆菌引起且PACs可在其中发挥良好价值这一前提,一组衡量 c-PAC对UPEC和奇异变形杆菌体外抗粘附活性的实验得出,UPEC不仅运动性和脲酶活力降低,且伴随着对HT1376细胞系和奇异变形杆菌粘附力的显著下降(高达75%),显示出较强的泌尿抗粘附活性[57]。

3.4 其他影响因素

体外实验结果显示,常见乳酸菌和荔枝果皮PACs的相互作用具有双向调控作用,PACs可以有效调控ST-01和L.casei-01为代表的乳酸菌的生长,反之乳酸菌也对PACs的代谢起促进作用,低聚糖、可溶性膳食纤维、ω-3脂肪酸等营养物质在其中发挥积极作用[58-59]。PACs和益生菌制剂的联合补充,既显示出了对感染产毒大肠杆菌小鼠肠道损伤的改善作用,又具有抑制肠外UPEC外入侵肠上皮细胞的能力[60-61]。同时,富含PACs的饲料被广泛应用于预防牧草气胀病,研究发现ω-3多不饱和脂肪酸与低剂量的PACs存在协同作用,促进了饲料基质中肠道微生物介导的PACs生物转化[62]。此外,诸如高糖高脂等饮食结构和食物加工方式也会干预PACs在动物或人体中的代谢效果,是二者相互作用的重要影响因素[63-64]。同时相关研究也指出,苹果基质中PACs细胞壁的相互作用则使人肠道微生物群对PACs的代谢降低,进而导致微生物代谢物作用下的抗炎效果下降[65]。

4 结语

PACs是一种广泛存在的天然多酚物质,经临床研究证实其副作用极低,较为安全[66],同时也凭借保健或药理作用的多样性,对多类慢性疾病具有潜在防治的作用,并有望在食品添加剂、膳食补充剂、保健品、药品的研发中发挥潜在价值。基于以上内容,存在如下问题需要明确:第一,样品获取有难度,分离提取技术的精进依旧是阻碍PACs深入研究的重要因素,诸如植物中不可提取多酚的提取分析方法的开发值得关注[5];第二,研究方法不全面,既有报道中实验结果多借助动物体外实验得出,有待进一步扩大研究对象及数量,借助更深层次的临床实验来证实;第三,研究及应用领域有待拓展,例如PACs在神经系统相关疾病的应用尚少,只在预防衰老、认知障碍、类抑郁行为等的方面有少许报道,有待广泛探究PACs对神经退行性疾病甚至是各类常见慢性疾病的影响。总之,二者相互作用的研究值得肯定,它不仅对研究对象本身具有双向的积极意义,同时也必将带动PACs相关生理功能与具体病症相关性的广泛研究,为防控各类不良症状和慢性疾病提供客观可能性。