基于UPLC-MS/MS同时分析福建乌龙茶和白茶中的儿茶素类物质

黄 彪,刘文静,方 灵,韦 航,吴建鸿,傅建炜,*

(1.福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,福建福州 350003; 2.福建省农产品质量安全重点实验室,福建福州 350003)

我国茶叶品种资源多,种植范围广,制作工艺历史悠久。一般根据外形、色泽及制作方法的不同将茶叶分为绿茶、红茶、黄茶、青茶(乌龙茶)、黑茶和白茶六大茶类[1]。不同茶叶生理功效和活性成分的研究一直是近些年来的热点。研究表明茶叶品质及其活性成分不仅与茶树品种相关[2-4],还与生长环境[5-6]、采摘时期[3]、加工工艺[7-9]等诸多因素相关。福建省茶树品种资源丰富,茶叶生产工艺独特,茶叶品质优良,较为出名的有乌龙茶 “铁观音”、“武夷肉桂”、“大红袍”、“武夷水仙”,白茶“福鼎白茶”、“政和白茶”等等。福建出产的茶叶香气醇厚,富含多种活性成分,尤其是乌龙茶与白茶等具有良好保健功效,经中医药理证明有消暑解毒,消炎治病的功效[10-11]。

茶叶因含茶多酚、咖啡碱、氨基酸、茶多糖、维生素等营养功能成分[12-13],其良好的抗衰老、抗癌变、杀菌和降低血糖等功效一直以来受到研究者的重视[14-16]。茶叶中的茶多酚主要包括儿茶素类、黄酮类、酚酸类、花色素类等物质,其含量占茶叶干重的20%左右;而具有抗氧化作用的儿茶素类物质占茶多酚总量的70%左右,主要包括儿茶素((+)-catechin,C)、表儿茶素((-)-epicatechin,EC)、没食子儿茶素((-)-gallocatechin,GC)、表没食子儿茶素(epigallocatechin,EGC)、儿茶素没食子酸酯((-)-catechin gallate,CG)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate,ECG),没食子儿茶素没食子酸酯((-)-gallocatechin gallate,GCG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)等物质。目前对儿茶素类物质的测定方法研究多采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)[17-19]。从灵敏度、准确性上看,HPLC法是目前较为有效的方法,但是HPLC方法往往存在前处理步骤繁琐、检测用时长等问题;而茶叶中的多酚物质多为易氧化的活性物质,检测时间长有可能造成检测结果不准确。而UPLC-MS/MS联用技术能将HPLC对复杂样品的高分离能力与MS的高选择性和高灵敏度有效结合起来,检测过程迅速,在农产品质量安全和食品检测的领域的应用日益广泛,但是运用LC-MS/MS技术对茶叶中活性物质多组分的分析仍不多见[20-22],而目前有关LC-MS/MS方法分析福建茶叶中活性物质含量的报道则更为少见。

本研究以福建乌龙产和白茶为研究对象,建立了同时快速分析茶叶中8种儿茶素物质的UPLC-MS-MS方法,分析比较了几种福建乌龙茶和白茶中儿茶素类活性物质含量,以期为福建茶叶资源的利用和产品开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乌龙茶铁观音(2018) 福建泉州市安溪县;肉桂(2018)福建武夷山市。白茶:白牡丹(2018)福建福鼎市;寿眉(2018)福建福鼎市;儿茶素(C)、表儿茶素表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)等 纯度>97%,南京道斯夫生物技术股份限公司;甲醇、乙腈、甲醇 色谱纯,Fisher公司;乙酸铵、甲酸 LC-MS级,Waters公司;其他试剂 均为国产分析纯。

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪、Xevo TQ-S三重四级杆质谱 美国Waters公司;XW-80A旋涡混合器 上海医科大学仪器厂;Millipore Direct-Q5超纯水仪 美国Millipore Qirect-Q5;SYG-2水浴恒温振荡器 常州朗越仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 UPLC-MS/MS方法样品前处理及标准溶液配制 样品前处理:称取0.2 g磨碎过筛后的茶样于10 mL棕色玻璃管中,加入在70 ℃预热过的70%甲醇溶液5 mL,混匀后置于70 ℃水浴中振荡提取10 min(每隔5 min搅拌一次),提取后冷却至室温,在3500 r/min转速下离心10 min,将上清液转移至10 mL容量瓶。残渣再用5 mL 70%甲醇溶液提取一次,重复以上操作。合并提取液定容至10 mL,摇匀,0.45 μm滤膜过滤,滤液稀释1000倍,待上机分析用。

标准溶液配制:精确称取标准物质各10.0 mg,分别用甲醇溶解后定容到10 mL,即得浓度为1000 μg/mL的不同标准品物质单标母液,备用。用于制作标准工作曲线的不同浓度的混标溶液,现配现用。

1.2.2 HPLC方法样品前处理及标准溶液配制 参照GB/T 8313-2018茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法。

1.2.3 UPLC-MS/MS方法色谱条件 色谱柱:Waters T3 C18柱(Φ1.8 μm,2.1 mm×50 mm);柱温:30.0 ℃;流速:0.2 mL/min;流动相A为0.1%(V/V)甲酸水溶液,流动相B为甲醇;洗脱梯度:0～3 min,90%～70% A;3～5 min,70%～30%A;5～8 min,30%～90% A;进样量:4 μL。

1.2.4 UPLC-MS/MS方法的质谱条件 参考文献质谱方法检测儿茶素的条件[23]。扫描方式:电喷雾离子源(ESI),正离子扫描模式;检测方式:多反应监测(MRM)模式;毛细管电压:2.5 kV;脱溶剂气:N2,流速800 L/h,脱溶剂温度:500 ℃;锥孔气流:N2,流速50 L/h;离子源温度:150 ℃;雾化气压力:0.28 MPa;碰撞气:氩气。以100 μg/L的儿茶素类物质的单标溶液进行质谱参数优化,确定特征母离子和子离子,优化后相关质谱参数见表1。

表1 8中儿茶素类物质检测的质谱参数条件Table 1 LC-MS/MS parameters for 8 catechin compounds

1.2.5 HPLC方法的色谱条件液相色谱条件 参照国标方法GB/T 8313-2018茶叶中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法色谱条件[24],实验在Waters e-2695高效液相色谱仪上完成。色谱柱:Waters CORTECS C18柱(4.6 mm×150 mm,2.7 μm);柱温:35.0 ℃;检测器:二极管阵列检测器;检测波长:278 nm;流速:1.0 mL/min;进样量:5 μL;流动相A和流动相B为按GB/T 8313-2018方法配制成的乙腈-水溶液。洗脱梯度:0～10 min,保持100% A;10～15 min,100%～68% A;15～25 min,保持68% A;25～30 min,68%～100% A。进样量:10 μL。

1.3 数据处理

UPLC-MS/MS方法数据的统计分析在Waters三重四级杆液相色谱串联质谱仪MassLynx软件上进行处理,实验重复3次,外标法定量。

2 结果与分析

2.1 提取条件的选择

国标方法[24]利用液相色谱法检测茶叶中儿茶素类物质,在将茶叶样品用70%甲醇溶液提取,得到提取液母液后,检测分析前加入稳定溶液(由10 mg/mL EDTA溶液25 mL,10 mg/mL抗坏血酸溶液25 mL,乙腈50 mL加入到500 mL容量瓶中定容后得到)。由于茶叶中多酚物质往往容易氧化,而茶叶中的多酚物质主要为儿茶素类物质,较容易氧化且由于种类较多,利用HPLC分离、检测往往耗时较长,为保持茶叶中儿茶素类物质的稳定性,保证结果的准确,往往需要加入稳定液。而UPLC和UPLC-MS/MS由于分离速度快,检测迅速,相关文献报道在利用70%甲醇溶液提取样品后进行UPLC和UPLC-MS/MS分析,一般不加入稳定溶液而直接进行上机检测[17]。另外利用超高效液相色谱—串联质谱仪进行检测分析,提取液通过色谱柱分离,经雾化器雾化后,经质谱检测器检测,应避免用无机酸及盐进入质谱仪以免对仪器造成损害。因此,实验建立UPLC-MS/MS方法检测茶叶中儿茶素类物质,在前处理过程中得到提取液母液,参考文献[17]提取方法,在母液中不添加稳定液。由于UPLC-MS/MS灵敏度较高,在得到母液后,稀释1000倍,经0.45 μm滤膜过滤后直接上机测试。

2.2 方法评价

2.2.1 标准工作曲线及检出限 将儿茶素类化合物标准品溶液按照1.2中小节中的条件进样,目标化合物的多反应监测色谱图如图1所示。在优化条件下,考察了8种目标化合物的线性范围,相关系数及检出限。在各化合物相应的浓度范围内,目标化合物的标准曲线标准溶液浓度(x,μg/L)与对应的峰面积(y)呈良好线性关系,相关系数(r)为0.9966～0.9994。依据特征离子色谱峰色谱信号的3倍信噪比(S/N(3)确定方法的检出限,方法的检出下限为0.2～1.1 μg/L(表2)。

表2 8种目标化合物的线性范围、线性方程、相关系数及检出限Table 2 Linear range,linear equation,correlation coefficient and detection limit of 8 target compounds

图1 8种儿茶素类化合物多反应监测色谱图Fig.1 Multiple reaction monitoring(MRM)chromatograms of 8 catechins

2.2.2 加标回收率 根据各目标物的响应信号情况及在茶叶中的含量情况进行了相应的加标实验(n=6),加标回收率为85.9%～109.1%,相对标准偏差(RSD)在0.9%～6.7%之间(表3),方法符合的检测要求。

表3 茶叶中8种儿茶素类物质测定的加标回收实验(n=6)Table 3 Recovery rates of 8 catechins compounds

2.2.3 精密度实验 选取2、5、10、50、100 μg/L 5个浓度的各化合物标准品溶液验证精密度,按照优化的实验条件进行测测试,每个浓度进行6次平行测试,结果表明:8种儿茶素类化合物标准品溶液含量的RSD均在0.032%～0.99%之间,说明该试验方法具有良好的精密度,符合分析测定的要求。

2.2.4 重复性实验 选取同一样品6份,按照建立的方法进行前处理得到样品提取液,同一批进样。结果表明样品检测出的7种儿茶素类物质含量的RSD均在0.28%～1.01%之间,表明该方法的重现性良好。

2.2.5 稳定性实验 将所得的样品提取溶液,测定24 h内各儿茶素组分的含量变化。根据标准曲线得出样品溶液各化合的含量,计算各组分含量的相对标准偏差RSD值来考察各组分在样品溶液的稳定性,结果表明儿茶素类物质的含量随时间呈下一定的下降趋势,但其含量的RSD值在0.061%～1.49%之间,虽然有下降但是下降幅度较小,样品溶液具有一定的稳定性,主要是因为儿茶素类物质长时间存放可能氧化的原因,说明在对样品进行提取后,检测迅速有利于结果的准确。

2.3 HPLC与UPLC-MS/MS检测茶叶中儿茶素类物质含量的比较

相对于HPLC,UPLC-MS/MS检测更为迅速、灵敏、准确。HPLC多通过对目标化合物的紫外吸收形成的色谱峰的识别而实现对物质的定性、定量,有时易产生假阳性;UPLC-MS/MS通过对目标化合物母离子、碎片子离子的识别实现对物质的定性、定量,但是在质谱检测中有时由于抑制效应影响碎片子离子的形成而对检测结果造成一定的影响。在实验中,选取样品分别利用UPLC-MS/MS与HPLC法对茶叶中儿茶素类物质含量的分析进行了比较,如表4所示,两种方法检测儿茶素类物质含量较为接近,儿茶素类物质的含量相对标准偏差(RSD)均<10%,说明建立的方法准确度高。

表4 HPLC与UPLC-MS/MS检测茶叶中儿茶素类物质含量比较(mg/g)Table 4 Comparison of detection results of HPLC and UPLC-MS/MS methods(mg/g)

2.4 茶叶样品的检测

选取采集的乌龙茶样品3份(其中铁观音2份,肉桂1份),白茶样品5份(其中白牡丹2份,寿眉3份)按照建立的方法,对茶叶中的儿茶素类化合物含量进行检测分析。每个样品重复测定3次,不同茶类样品中儿茶素类物质含量的检测结果见表5所示。

表5 不同工艺的茶类其活性成分含量(mg/g)Table 5 Contents of ten bioactive compounds in different tea samples(mg/g)

从实验结果来看,相对于其它儿茶素类物质,表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)在茶叶中的含量最高,约占茶叶中儿茶素总量的60%。分析所收集的几种福建茶叶样品,乌龙茶中儿茶素总量的含量范围为43.59～45.21 mg/g,白茶儿茶素总量的含量范围为50.52～70.71 mg/g。白茶中EGCG及儿茶素总量较乌龙茶中高,这主要因为白茶加工工艺相对简单,其生产加工主要是茶鲜叶经过长时间的萎凋,然后烘干。在长时间的萎凋过程中,儿茶素类物质在多酚氧化酶、过氧化物酶等作用下发生缓慢而轻度的氧化反应,茶叶中儿茶素的主要成分EGCG含量有一定程度的减少,儿茶素总量也会有所降低。而乌龙茶作为一种半发酵茶,其制作工艺相对复杂,晒青、凉青、做青等工序历时较长,发生以多酚类酶促氧化作用和水解作用为主导的一系列生化反应,EGCG含量下降较多,儿茶素总量的变化也较大。

3 结论

建立UPLC-MS/MS方法对茶叶中的儿茶素类物质进行检测,方法简便、快速,有效缩短分析时间。运用该方法对福建省几种茶叶中的儿茶素类物质进行了分析,所收集的样品中EGCG在茶叶中的含量均为最高。由于品种与加工工艺的不同,相对来说,白茶样品中EGCG的含量与儿茶素的总量较乌龙茶高。本研究建立的方法可为茶叶中多种活性物质的分析提供参考,本研究的实验结果可为茶叶品质与营养功能的进一步研究提供科学依据,对于不同茶叶资源的开发研究具有一定的参考意义。