QuEChERS-气相色谱-三重四极杆质谱法同时测定枸杞中46种农药残留

李 莎,曾习文,李亦蔚,易守福,董 艳

(1.长沙县食品安全检测中心,湖南长沙 410100; 2.湖南省食品质量监督检验研究院,湖南长沙 410017)

枸杞(Lyciumbarbarum)为茄科类灌木,是我国传统的药食同源植物。枸杞主要含有胡萝卜素、核黄素、酸浆果红素、抗坏血酸、烟酸、甜菜碱及微量元素等化学成分,具有补肾养肝、润肺明目、降血糖、降血脂等多种功效[1-2],其丰富的营养价值和保健功效倍受人们的青睐。由于枸杞含糖量高,易发生木虱、实蝇、瘿螨、蚜虫等虫害,且防治难度大[3-4]。目前大部分市售枸杞来源于人工栽培,规模化种植使得大面积病虫害的发生较为频繁和严重。为了提高产量,大量使用多种农药进行防治,造成枸杞农药残留严重,影响枸杞质量安全[5-6]。近年来,随着国际贸易竞争的不断加剧以及各国对食品安全要求的提高,欧盟、美国、日本等国家都对枸杞产品制定了严格的农药残留限量,然而我国出口枸杞中农药残留超标被官方通报的情况时有发生。农药残留问题已经成为我国枸杞出口所遭遇的主要技术性贸易壁垒。因此,建立枸杞中快速、准确、高效的多农药残留检测方法对于控制枸杞农药残留污染、促进枸杞产业健康发展至关重要。

目前对于枸杞中农药残留量的主要检测方法有气相色谱法(GC)[7-9]、高效液相色谱法(HPLC)[10-12]、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[13-15]及气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[16-17]。气相色谱-质谱联用法兼具气相色谱高分离效能和质谱准确鉴定化合物结构的特点,可达到同时定性定量的检测目的。但单级质谱灵敏度和选择性不理想,易受基质成分干扰,GC-MS/MS相对于传统的GC-MS而言,在农药残留检测领域具有高效、稳定、基质干扰小等突出优点。目前,将GC-MS/MS检测技术用于枸杞中农药残留检测的研究报道较少,方翠芬等[18]采用乙酸乙酯提取浓缩枸杞样品,建立了测定枸杞中23种农药残留量的GC-MS/MS方法。由于枸杞中含有大量色素及多糖类物质,基质复杂,在质谱分析中可能带来严重的基体效应和干扰,在进行仪器分析前,需采取适当的前处理方法去除基质中的干扰物。现行的国家标准及文献报道方法[14,19]多采用固相萃取法(SPE)进行净化,SPE柱净化效果虽好,但价格较昂贵,且操作繁琐。QuEChERS方法具有操作简便、快速、净化效率高、消耗有机溶剂少、成本低等优点,被广泛应用于复杂基质中多农药残留的检测[20]。

本研究将GC-MS/MS检测系统与QuEChERS前处理方法结合,用于枸杞中多种农药残留快速提取检测。样品经乙腈提取,提取液通过QuEChERS法净化排除复杂基体的测定干扰,利用GC-MS/MS在MRM模式下直接测定,建立了同时测定枸杞中46种农药残留的方法。该方法高效、快速、灵敏、准确,能满足枸杞中农药残留的检测要求,可为枸杞的质量控制提供技术手段。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枸杞样品 购自超市和药店;46种农药标准品(46种农药标准品名称见表1,1000 μg/mL) 北京坛墨质检科技有限公司;乙腈、正己烷、丙酮 色谱纯,德国默克公司;无水硫酸镁、氯化钠 分析纯,国药集团化学试剂有限公司;净化管1号(含150 mg MgSO4填料) 自制;净化管2号(含150 mg MgSO4,50 mg N-丙基乙二胺(N-propyl ethylenediamine,PSA)填料)、净化管3号(含150 mg MgSO4,50 mg PSA,50 mg C18填料)、净化管4号(含150 mg MgSO4,50 mg PSA,50 mg C18,7.5 mg石墨化碳黑(Graphitized carbon black,GCB)填料) 安捷伦科技有限公司。

Agilent 7890B-7000C气相色谱-三重四极杆质谱仪 美国Agilent公司;TD5K台式离心机 长沙东旺实验仪器有限公司;XY-100高速多功能粉碎机 浙江省永康市松青五金厂;MS3 digital旋涡混匀器 IKA仪器设备有限公司;KQ-500B型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;AL204电子天平 梅特勒托利多有限公司;HN132样品浓缩仪 济南海能仪器有限公司;SMART-NE超纯水仪 上海康雷分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理 提取:称取经粉碎均匀枸杞试样5.00 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中,加10 mL超纯水涡旋混匀,静置30 min。精密加入10 mL乙腈,剧烈振荡涡旋2 min,加入2 g NaCl后剧烈振荡涡旋2 min,再以4000 r/min的转速离心3 min,上清液待净化。

净化:准确移取上清液2 mL,置于预先装有加入150 mg MgSO4,50 mg PSA的净化管中,剧烈振荡涡旋2 min,再以4000 r/min的转速离心3 min,精密移取清液1 mL,氮吹干后用丙酮溶剂定容至0.5 mL,过0.22 μm有机滤膜,供GC-MS/MS分析检测。

1.2.2 标准溶液配制及标准曲线绘制 混合标准中间液:分别吸取0.10 mL 1000 μg/mL各农药标准液置于10 mL容量瓶中,用丙酮定容,得到10 μg/mL的混合标准中间溶液,于-18 ℃下避光、密封保存。

混合标准使用液:精确吸取一定量的混合标准中间溶液,逐级用丙酮释成质量浓度为0.01、0.02、0.04、0.08、0.10、0.20 μg/mL的混合标准使用液。

基质混合标准使用液:取6份1 mL按1.2.1制备的空白基质溶液氮气吹干,分别加入1 mL上述相应质量浓度的混合标准使用液复溶,配制成系列基质混合标准使用液。以46种农药的基质标准使用液的质量浓度为横坐标,各物质的定量离子对峰面积为纵坐标,绘制基质匹配标准曲线。

1.2.3 色谱条件 色谱柱:HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm,美国Agilent公司);载气:高纯氦气(99.999%);碰撞气:高纯氮气(99.999%);恒流模式流速:1.0 mL/min;进样方式:不分流进样,进样量:1 μL;进样口温度:280 ℃;柱温:初始温度40 ℃保持1 min,以40 ℃/min升温至120 ℃,再以5 ℃/min升温至240 ℃,最后以12 ℃/min升温至300 ℃,保持6 min。

1.2.4 质谱条件 电离方式:电子轰击离子源(EI);电离能量:70 eV;离子源温度:280 ℃;四级杆温度:150 ℃;传输线温度:280 ℃;扫描模式:多重反应监测(MRM),46种农药残留的保留时间、定量离子对、定性离子对、碰撞能量条件见表1。

表1 46种农药化合物的保留时间及质谱采集参数Table 1 Retention time and mass spectrometric parameters of 46 pesticide compounds

1.3 数据处理

采用Agilent MassHunter软件进行数据采集及处理。

2 结果与分析

2.1 仪器条件的优化

分别对46种农药化合物进行全扫描,选择2～3个特征且丰度高的离子作为母离子。再分别对每个母离子进行子离子扫描,设定碰撞电压在5～35 eV之间,每隔5 eV进行1次碰撞优化碰撞能量,择优选取强度和信噪比兼顾的离子对分别作为定量和定性离子对。本文选用Agilent HP-5MS柱,在分离过程中采用程序升温可有效地改善峰形,通过分段离子扫描可有效提高仪器检测灵敏度。经过优化,46种农药残留组分多反应监测模式条件及保留时间如表1所示。

气相色谱-三重四极杆质谱法检测100 ng/mL氧乐果等46种农药化合物基质混合标准溶液,所得总离子流图如图1所示。

图1 46种农药混合基质标准溶液的总离子流图Fig.1 TIC of 46 pesticide mixed matrix standard solutions 注:峰形上方的编号与表1中各组分编号代表的农药名称一一对应。

2.2 样品前处理方法的考察

2.2.1 提取溶剂的选择 以加入100 μg/kg农药混标的枸杞样品为研究对象,考察了丙酮、乙腈、正己烷三种不同溶剂对各农药组分的提取效果。结果表明46种农药组分在丙酮、乙腈、正己烷三种溶剂中的平均回收率分别为86.62%、89.75%和67.53%。正己烷极性相对较弱,不利于提取极性较大的农药组分;使用丙酮提取液中色素等杂质较多,容易造成仪器污染并影响检测结果;乙腈提取效果最好,农药回收率高,由于乙腈适宜于萃取极性范围较宽的多种农药,且不易提取色素和脂肪等非极性成分[21],使净化更简便且提取效果最好,所以本实验选择乙腈作为提取溶剂。

2.2.2 净化剂的选择 本实验以2 mL离心后的100 μg/kg加标样品提取液为研究对象,对MgSO4、PSA、GCB、C18的种类和用量进行优化。对比4种净化管(填料配比详见1.1)的净化效果,结果表明,随着填料种类的增加,净化液越来越澄清(图2),说明净化效果越好,表明PSA、C18和GCB在枸杞前处理过程中都发挥了相应的除杂效果。同时,对4组填料下46种农药的回收率进行比较,发现含150 mg无水硫酸镁、50 mg PSA的净化剂(2号净化管)不仅可以将枸杞样品中的杂质净化,且对目标农药的吸附少,各农药组分的平均回收率最高,均在80%～100%范围内。这是因为枸杞中主要含多糖类、胡萝卜素、纤维素等营养成分,PSA可将其有效吸附;C18和GCB的加入虽对色素去除更彻底,但也对极性较弱和平面结构的农药有较强的吸附作用,使目标组分的回收率降低[20,22]。因此,本方法优先采用2号净化管(含150 mg MgSO4,50 mg填料)对枸杞提取样液进行净化处理。

图2 4组混合填料的净化效果Fig.2 Purification effects of thefour groups of mixed adsorbents

2.3 基质效应

基质效应是样品中其他组分对待测物离子化的影响,导致在进行仪器分析时待测组分的响应出现增强或抑制。基质效应用ME表示,ME(%)=(B-A)/A×100(A和B分别为溶剂和基质标准曲线的线性方程斜率),︱ME︱<10%提示基质效应较小,可用溶剂标准曲线进行定量;10%<|ME|<50%提示基质效应较大,需要用基质标准曲线进行定量以消除基质效应对结果的影响;︱ME︱>50%提示基质效应很强,严重影响定量,需要重新优化样品前处理方法[23]。

本研究分别采用空白基质提取液和丙酮溶剂配制成0.01、0.02、0.04、0.08、0.10、0.20 μg/mL的标准工作液,在相同条件下进行检测,最后分别建立基质标准曲线和溶剂标准曲线,通过上述公式计算ME值,判断基质效应。结果发现各农药组分的ME值均在10%～50%之间(见表2),表明存在明显的基质增强效应,在本研究中使用基质匹配外标法对46种农药的残留量进行准确定量。

2.4 线性关系、相关系数和检出限

将46种农药配制成6个不同质量浓度的混合基质标准溶液,分别为0.01、0 02、0.04、0.08、0.10、0.20 μg/mL。如表2所示,各组分在相应浓度范围内呈良好的线性关系,线性相关系数r在0.9941～0.9999之间。以信噪比S/N=3和S/N=10所对应的浓度,分别计算各农药组分的检出限和定量限,方法检出限为0.02～3.90 μg/kg,定量限为0.05～12.99 μg/kg(见表2)。

2.5 方法的回收率和精密度

在空白枸杞样品中添加浓度分别为10、50、100 μg/kg的46种农药标液,涡旋2 min,静置2 h,按上述所选择的最优条件进行测定,每个添加水平做6次平行实验,计算平均加标回收率和相对标准偏差。测得平均回收率为71.5%～99.8%,相对标准偏差(RSD)为0.7%～8.9%,实验结果见表2。枸杞样品检测结果的精密度和准确度均达到GB/T 27404-2008中农药残留检测的要求。

表2 枸杞中46种农药的线性方程、相关系数、基质效应、检出限、定量限、回收率和相对标准偏差(n=6)Table 2 Linear equations,correlation coefficients,matrixeffects(MEs),limit of detection(LOD),limit ofquantification(LOQ),recoveries and standard deviations of 46 pesticide residues in Lycium barbarum(n=6)

2.6 实际样品测定

采用本方法对10批次枸杞样品中46种农药残留量进行测定,结果4批样品检出农药残留,其余样品均未检出。其中有2批样品检出克百威,且含量超出GB 2763-2016规定的限量值20 μg/kg,含量分别为66.7和40.2 μg/kg;另有2批样品检出毒死蜱分别为39.2、26.3 μg/kg,1批样品检出腐霉利19.4 μg/kg,2批样品检出氯氟氰菊酯分别为135、130 μg/kg,1批样品检出氟氯氰菊酯262 μg/kg,含量均未超过国家限量值,测定结果见表3,部分阳性样品的色谱图见图3。

表3 4批枸杞农药残留测定结果(μg/kg)Table 3 Determination results of pesticide residuesin the 4 batches of Lycium barbarum(μg/kg)

图3 枸杞样品-3的MRM谱图Fig.3 MRM chromatogram of Lycium barbarum-3 sample

3 结论

本文首次将QuEChERS前处理方法结合GC-MS/MS检测技术用于枸杞中多种农药残留的快速分析检测。用此方法检测枸杞中46种农药残留时,在0.01～0.20 μg/mL范围内线性关系良好,检出限和定量限分别为0.02～3.90和0.05～12.99 μg/kg;3个不同浓度添加水平的平均回收率为71.5%～99.8%,相对标准偏差为0.7%～8.9%,均能满足检测要求。10批次枸杞样品中4批次检出农药残留,部分枸杞中存在农药残留超标的情况,提示枸杞生产过程中存在不规范使用农药的情形,因此,对枸杞农药残留进行有效监控非常必要。该方法简单、快速、选择性好、灵敏度高,能够满足枸杞中多种农药残留的定性及定量检测,可为枸杞的质量控制提供技术支撑。