狗源性DNA检测试剂盒的研制与评价

王天添,刘佳琳,李亚晗,王艳双,李明成,3,孙丽媛,*

(1.北华大学医学技术学院,吉林吉林 132013; 2.北华大学医学院,吉林吉林 132013; 3.吉林省中药DNA指纹检测技术科技创新中心,吉林吉林 132013)

狗肉,又叫“香肉”、“白狗”,有至尊肾宝的美誉,口感细嫩,肉质密且饱满。《本草纲目》中记载,“狗肉滋气补血,行二经而瞬时暖胃祛寒,服之气血溢沛,百脉沸腾”[1]。由于纯正的食用狗肉数量稀少,价格昂贵,很多不法商贩用非法狩猎或者养殖场淘汰的毛皮动物肉替代。近年来,有毒狗肉“链”上餐桌事件屡屡发生[2]。目前市面上最常见掺假狗肉的伪品为狐肉、貂肉,也是最可能对人体存在危害性的两大掺假物种。2011年12月8日,沈阳晚报记者曾暗访所谓低价的“正宗狗肉”店,发现其酱狗肉其实就是狐狸肉和貉子肉。据统计,我国北方狐、貂年饲养量近10000万只。作为皮毛经济动物,养殖过程中添加激素类饲料不可避免,甚至定期注射抗生素药品,致使动物体内残留超标的激素及抗生素药物。失去毛皮的狐肉、貂肉被不法商贩大量低价收购,掺假到价格较高、特别是与其种属相近的狗肉中[3]。此类掺假狗肉一旦作为食品进入市场,不仅损害消费者的身体健康,而且严重侵犯消费者权益。本研究主要针对这两种掺假肉研制试剂盒,用以检测狗肉中是否掺杂狐肉、貂肉。

随着科学技术的发展,越来越多的检测技术被应用于掺假肉类检测[4-12],在众多检测方法中,基于DNA序列的种属特异性强的PCR技术应用最为广泛,包括传统PCR、多重PCR、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)、实时荧光定量PCR(Real-time PCR)以及数字PCR(Digital PCR)。PCR-RFLP需要设计特异性酶进行鉴别,但酶切位点易发生随机突变,重复性较差;实时荧光定量PCR和数字PCR准确度高,灵敏性强,但所需仪器较为昂贵,不易普及;传统PCR以及多重PCR相对来说操作更为简单便利,所需仪器价格更为经济,适用于基层单位。

本研究应用物种特异性PCR技术研制狗源性DNA检测试剂盒,选取高灵敏度、高特异性的狗、狐、貂源性引物组装试剂盒,以期达到准确检测狗肉及其伪品(狐肉、貂肉)的目的,广泛应用于狗肉质量标准检测,为狗肉质量监管提供有力支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

狗、狐、貂肉标准品 本省食品药品检测中心;市售样品 当地超市、农贸市场、以及网络店铺;2×Taq PCR MasterMix、100 bp DNA Marker、λDNA HindIII、普通琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒、质粒小提试剂盒、pGM-T连接试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞 北京天根生化科技有限公司;其他试剂 国产分析纯。

MX-S型漩涡混匀器 美国赛洛捷克公司;DKT200-1型恒温金属浴 美国科路森科学实验仪器有限公司;JY300E通用型电泳仪 北京君意东方电泳设备有限公司;TC9600-G多功能梯度PCR仪 美国Labnet公司;UV WHITE-2020D紫外凝胶成像分析仪 美国Biorad公司;NanoDrop One微量核酸蛋白测定仪、Thermo Fisher高速离心机 美国Thermo公司;ZW-800G全封闭智能匀浆仪 温州维科生物实验设备有限公司;YXQ-LS-75S11立式蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 狗源性DNA成分检测

1.2.1.1 DNA提取 根据试剂盒手册,称取待测样品约0.05 g,分别置于干净Ep管中,依次加入P1(Tris-HCl、EDTA、NaCl、10% SDS、PK酶和ddH2O)溶液500 μL、P2(10% SDS)溶液30 μL、P3(PK 酶)溶液15 μL,混匀,56 ℃水浴振荡1 h;加入P4(饱和乙酸钠)溶液500 μL,充分混匀10 min,10000 r/min离心10 min;取上清液加入等体积P5(异丙醇)溶液,-20 ℃放置10 min,10000 r/min离心10 min;弃上清液,加入70%冰冻乙醇溶液500 μL,混匀,11000 r/min离心10 min,弃上清液(重复该步骤1次);室温晾干后,加入P6(ddH2O)溶液100 μL溶解DNA,混匀,即得肉样DNA溶液。

1.2.1.2 DNA浓度、纯度检测 紫外分光光度计测待检DNA浓度,每个样品测定3次,取平均值,根据OD260/280比值计算待检DNA纯度。

1.2.1.3 特异性引物设计 GenBank中下载狗种属基因序列(GenBank:KU291093.1)、狐狸种属基因序列(GenBank:LT560065.1)、貂种属基因序列(GenBank:KU146454.1),应用NCBI Primer BLAST在线引物设计软件设计狗、狐狸、貂种属特异性引物(见表1),送至深圳华大基因科技服务有限公司合成。

表1 特异性引物序列Table 1 Specific primer sequence

1.2.1.4 PCR反应 PCR反应体系:2×Taq PCR Master Mix 10 μL,引物 F、R(10 ng/μL)各1 μL,DNA 模板(10 ng/μL)1 μL,无菌ddH2O补足至20 μL。PCR反应参数:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30 个循环;72 ℃延伸 10 min,4 ℃保存。

1.2.1.5 PCR产物检测 1.5% 琼脂糖凝胶,85 V/cm 电泳85 min，紫外分析仪观察。正品狗肉应在481 bp处有单一明亮条带。

1.2.1.6 种属特异性基因片段克隆 凝胶回收狗、狐、貂特异性DNA片段,纯化、连接后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α,蓝白筛选阳性克隆;经测序验证,分析比对结果,将经 PCR 鉴定后的质粒稀释至10 ng/μL作为试剂盒的阳性对照。

1.2.2 狗源性DNA检测试剂盒组装 试剂盒为20次用量,包括DNA提取体系和PCR扩增体系(见表2)。

表2 狗肉DNA检测试剂盒组成Table 2 DNA detection kit of dog meat

1.2.3 狗源性DNA检测试剂盒评价

1.2.3.1 特异性评价 检验人员在对样品真伪不知情的情况下,对随机批次样品进行盲检验证试剂盒特异性。

1.2.3.2 稳定性评价 从已配置完善的试剂盒中随机抽取2份,一份于室温和-20 ℃反复冻融5、10、15 和 20 次,一份于制备后的当日及每间隔3个月,检测试剂盒各试剂稳定性、有效性,分别检测狗肉正品、掺假品及阳性、阴性对照品各1次,直至检测结果与真实结果不符为止。

1.3 数据处理

PCR扩增产物凝胶电泳图谱均由紫外透射反射分析仪进行成像分析,使用Photoshop CS6进行处理。

2 结果与分析

2.1 狗肉、狐狸肉、貂肉基因组DNA提取结果

0.8%琼脂糖凝胶电泳结果显示,各泳道均可得到20000 bp左右的DNA条带,条带清晰,抹带较少,证明本方法提取的DNA质量高,碎片较少,可成功提取狗肉等基因组DNA(见图1)。

图1 狗肉、狐肉、貂肉基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果Fig.1 Genomic DNA agarose gel electrophoresis ofdog meat,fox meat and scorpion meat注:M:λHindIII Marker;1:狗;2:狗;3:狐;4:狐;5:貂;6:貂;N:空白对照。

2.2 狗肉、狐狸肉、貂肉DNA浓度及纯度

紫外分光光度计测定,所提取DNA浓度皆不低于100 ng/μL,OD260/280值均居于1.80～2.10之间,证明本方法可有效提取狗肉等基因组DNA(见表3)。

表3 狗肉、狐肉、貂肉DNA浓度及纯度检测结果Table 3 DNA concentration and purity ofdog meat,fox meat and clam meat

2.3 引物特异性试验结果

狗、狐、貂所对应泳道分别在481、393、289 bp处出现单一特异性条带,清晰明亮,证明引物具有良好特异性(见图2)。

图2 狗肉、狐肉、貂肉引物特异性试验琼脂糖凝胶电泳结果Fig.2 Agarose gel electrophoresis of cockroach primerspecific test of dog meat,fox meat,and clam meat注:M:100 bp DNA Ladder;1:狗;2:狗;3:狐;4:狐;5:貂;6:貂;N:空白对照。

2.4 引物灵敏性试验结果

DNA稀释至10-4ng/μL时,仍可在481 bp处见浅带,证明引物具有良好灵敏性,最低检测限为10-4ng/μL(见图3)。

图3 狗肉引物灵敏性试验琼脂糖凝胶电泳结果Fig.3 Agarose gel electrophoresis ofprimer sensitivity of dog meat注:M:100 bp DNA Ladder;1:100 ng/μL;2:10 ng/μL;3:1 ng/μL;4:10-1 ng/μL;5:10-2 ng/μL;6:10-3 ng/μL;7:10-4 ng/μL;8:10-5 ng/μL;9:10-6 ng/μL;10:10-7 ng/μL;N:空白对照。

2.5 克隆结果及比对结果

经过NCBI-BLAST 比对,所测狗、狐、貂核苷酸序列分别与GenBank中已登记的狗、狐、貂相似性为100%,证明所克隆DNA片段即为目的基因片段。

2.6 狗源性DNA检测试剂盒评价

2.6.1 特异性评价 正品均在481 bp处出现单一特异明亮条带,伪品均未出现条带,证明该试剂盒具有良好特异性(见图4)。

图4 试剂盒特异性试验琼脂糖凝胶电泳结果Fig.4 Agarose gel electrophoresis of kit specific test 注:M:100bp DNA Ladder;1:狗,阳性对照;2:狐,阳性对照;3:貂,阳性对照;4:狗;5:狐;6:貂;N:空白对照;图5～图9同。

2.6.2 稳定性评价 试剂盒反复冻融5、10、20 次后,均可成功提取狗肉DNA,并扩增出481 bp的目的条带;-20 ℃保存试剂盒1年,期间每3个月检测一次,结果均一致,证明本试剂盒反复冻融20次或在-20 ℃保存一年,仍可有效检测(见图5、图6)。

图5 试剂盒特异性试验琼脂糖凝胶电泳结果(反复冻融20次)Fig.5 Agarose gel electrophoresis results of Kit specifictest(Repeated freezing and thawing 20 times)

图6 试剂盒特异性试验琼脂糖凝胶电泳结果(-20 ℃保存一年)Fig.6 Agarose gel electrophoresis resultsofkit specific test(-20 ℃ for one year)

2.7 市售样品检测

应用本研究所研制试剂盒对12份随机狗肉样本进行鉴别检测,检出3份伪品。如图7,5号泳道见393 bp的单一条带,与2号泳道狐-阳性对照所显现条带位置相同,说明为狐肉冒充的伪品狗肉;如图8所示,5、6号泳道皆见单一条带(393、289 bp),分别于左侧2、3号泳道狐-阳性对照、貂-阳性对照条带位置相同,说明此份样品同时掺杂狐、貂源性成分;图9中仅6号泳道见289 bp单一条带,则为貂肉冒充的伪品狗肉;剩余样品皆无狐、貂源性成分掺假。

图7 市售样品检测琼脂糖凝胶电泳结果Fig.7 Agarose gel electrophoresis resultsof commercial sample detection

图8 市售样品检测琼脂糖凝胶电泳结果Fig.8 Agarose gel electrophoresis resultsof commercial sample detection

图9 市售样品检测琼脂糖凝胶电泳结果Fig.9 Agarose gel electrophoresis resultsof commercial sample detection

3 讨论

随着狗肉的众多食用药用价值被发现,愈来愈多人喜食狗肉[13],同时,狗肉掺假现象也日渐增多[14]。PCR技术广泛应用于肉制品检测,尤其用以鉴别猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉等常见肉居多[15-22],但鉴别掺假狗肉的研究少之又少。高晓丽等[22]应用荧光PCR技术对食品中狗源性成分进行检测,以狗ND2基因特异性引物对猪肉、牛肉、羊肉、鸭肉等14中动物源性DNA进行扩增,但未提及现今最常见狗肉掺假物种(狐肉、貂肉);刘艳艳等[3]建立了饲料中狐狸、水貂、狍子狗源性成分的荧光PCR检测方法,用以检测反刍动物饲料中狐狸、水貂、貉子及狗源性成分,但未涉及食用肉制品中狐、貂源性成分检测,并且荧光PCR技术虽检测灵敏度高、特异性好,但所需检测试剂、仪器皆较为昂贵,实验操作较复杂,不易于普及,本研究应用常规PCR技术,对狗肉及最常见狗肉伪品(狐肉、貂肉)进行鉴别检测,最低成本下保证检测结果准确性,更易于普及基层。

本研究以线粒体的细胞色素B区域基因为靶基因设计种属特异性引物,为获得高纯度的DNA,对SDS 碱变性法及提取步骤进行了优化,可有效沉淀蛋白质,提高DNA提取效率,且提取结果稳定,OD260/280可达2.02±0.009,操作简便,安全无毒。通过对反应体系及条件摸索,确定Tm值为56,引物模板量为1 μL时,PCR扩增效率最高,正品狗肉皆在481 bp处出现单一明亮条带,伪品无相应条带。灵敏性试验表明,在模板浓度低至10-4ng/μL时,仍可出现特异浅带。对随机抽取的12份样品进行试剂盒检测,有1份掺杂狐肉,1份为狐肉、貂肉混合伪品,1份为貂肉伪品。该结果与食品药品检验中心结果一致,证明本试剂盒具有良好准确性及特异性。反复冻融试剂盒20次,仍可实现稳定检测。

4 结论

本文所研发狗源性DNA检测试剂盒具有良好特异性、灵敏性以及稳定性,可于4.5 h内完成全部检测,且在同一反应体系中同时检测狗、狐、貂三种成分。-20 ℃保存1年,仍能稳定检测。相较其他常见掺假肉类鉴别方法,该试剂盒不仅准确度高、特异性好、灵敏性强,而且可操作性高,更易普及,可以很大程度上减轻质检工作人员的工作量。由于试剂盒的形式更为便捷,使操作人员及地点不受限制,可广泛应用到狗肉的质量监督工作中,在肉制品质量考察方面具有广泛的应用前景。未来本团队将进一步完善该试剂盒,更大程度上提高检测效率,节省检测成本。