脂溶性天然抗氧化剂对甲鱼油稳定性的影响

宋恭帅,张蒙娜,俞喜娜,王 杰,王宏海,李诗言,沈 清,3,*

(1.浙江工商大学海洋食品研究院,浙江杭州 310012; 2.浙江省水产质量检测中心,浙江杭州 310023; 3.浙江省水产品加工技术研究联合重点实验室,浙江杭州 310012)

甲鱼油中含有铁、锌、硒、铜等微量元素和丰富的花生四烯酸、亚麻酸、油酸、EPA、DHA等n-3多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFA)[1]。研究表明,EPA、DHA具有健脑明目、降血压、降血脂、增加血液循环及抗炎等生理功效,且在临床上已被用于治疗和预防动脉硬化等相关疾病[2]。然而,甲鱼油中的n-3 PUFA极易受到化学、物理及生物因素作用的影响，产生一些影响其感官和品质的次级氧化产物,如己醛、壬醛、庚醛等,最终导致产品产生酸败气味、营养价值与可接受性的降低及货架期的缩短等不良后果[3-5]。因此,在甲鱼油中适量添加抗氧化剂可以减缓脂肪酸的氧化、延长贮藏及货架期限等。

抗氧化剂可分为天然和合成抗氧化剂两大类。天然抗氧化剂主要来源于天然可食用的物质中,如香辛料、蔬菜、中草药及某些发酵产品,具有安全性高、无毒副作用等特点,将其作为抗氧化剂添加到鱼油中将成为一种趋势[6-7]。天然抗氧化剂主要包括脂溶性与水溶性两类,水溶性抗氧化剂如VC、茶多酚、植酸等,在油脂中的溶解度小、作用效果差;脂溶性天然抗氧化剂主要包括脂溶性茶多酚(LTP)[8]、VE、脂溶性迷迭香提取物(LRO)[9]及大部分类胡萝卜素等。LTP是一种优良的供氢体,具有活泼的羟基氢原子,能捕获过量脂肪酸自由基,使自由基转化为惰性化合物,从而阻止自由基的连锁反应[10]。VE又称α-生育酚是一种重要的抗氧化剂,在油脂中主要通过清除不饱和脂质自由基,达到抑制油脂氧化的目的[11]。LRO中脂溶性高效抗氧化物为酚类双萜化合物,而其中最主要的活性物质为鼠尾草酚和鼠尾草酸[12]。国内外研究报道了脂溶性抗氧化剂在粮油中的抗氧化作用,如许冲[13]利用脂肪酶作用将茶多酚(TP)转性成LTP,增加了其在大豆油中的溶解度,并通过抗氧化试验证实了LTP的抗氧化效果明显优于TP、二丁基羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)、VE等。朱雪梅等[14]将不同浓度的α-生育酚添加到菜籽油、花生油及芝麻油中,通过测定过氧化值(POV)、茴香胺值与总氧化值表明不同浓度α-生育酚在油脂中的抗氧化效果的差异较大。Samotyj等[15]以大豆油为原料,对比LRO、α-生育酚和BHT在大豆油中的抗氧化活性后发现,LRO的抗氧化作用更强,能更有效地减少大豆油中产生的氧化产物。但是,有关脂溶性天然抗氧化剂在动物油脂贮藏过程中的脂肪酸败、氧化、腥味等不良风味产生的研究鲜有报道。

本文以酸价(AV)、过氧化值(POV)、挥发性风味变化及脂肪酸组成为评价指标,研究贮藏过程中LTP、VE、LRO这三种脂溶性天然抗氧化剂对甲鱼油的抗氧化作用,旨在为提高甲鱼油的贮藏稳定性和延长货架期提供理论支持,促进甲鱼加工过程中内脏和脂肪块的综合利用,并对油脂中抗氧化剂的选择具有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲鱼油 取自内脏,由浙江省水产质量检测中心提供;37种脂肪酸甲酯混标 美国Sigma公司;LTP 杭州普丽美地科技有限公司;VE苏州佰耀生物科技有限公司;LRO 河南森源本草天然产物股份有限公司;其他试剂 均购于西陇化工股份有限公司。

50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)涂层萃取头 美国Supelco公司;7890A气相色谱仪 美国Agilent 公司;Trace GC Ultra气相色谱、DSQ Ⅱ质谱联用仪 美国Thermo Fisher Scientific公司;LRH-150-S 恒温恒湿培养箱 广东省医疗器械厂;ROTINA 420R离心机 德国Hettich科学仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 抗氧化实验 参照Chakraborty等[16]设计的Schaal加速氧化法。分别称取80 g甲鱼油置于100 mL棕色细口玻璃瓶中,共13瓶,分三个实验组(编号:1、2、3),每组4瓶(编号:1a、1b、1c、1d;2a、2b、2c、2d;3a、3b、3c、3d),剩余1瓶样品设为空白对照。1、2、3号实验组分别添加LTP、VE和LRO,且各组添加浓度梯度为0.02%、0.04%、0.06%、0.08%(添加浓度(%)=M抗氧化剂(g)/M甲鱼油(g)×100),置于(65±1.5) ℃的恒温箱中12 d,并每2 d测定其AV、POV,脂肪酸组成及挥发性成分,每组做3次平行。

1.2.2 酸价和过氧化值测定 参考GB 5009.229-2016《食品中酸价的测定》[17]中的冷溶剂指示剂滴定法测定酸价。参考GB 5009.227-2016《食品中过氧化值的测定》[18]中的滴定法测定过氧化值。

1.2.3 脂肪酸组成分析

1.2.3.1 甲鱼油甲酯化 称取0.1 g甲鱼油和2 mL 0.5 mol/L NaOH-MeOH溶液置于具塞试管中,振荡摇匀后放入65 ℃水浴锅中加热30 min,取出并自然冷却至室温,再加入2 mL 15% BF3-MeOH溶液,振荡摇匀后置于65 ℃水浴锅中加热3 min,取出并自然冷却至室温,加入2 mL正己烷萃取,静置分层后取上层清液,并加入约占1/10体积的无水Na2SO4脱水,将处理好的上层清液用气相色谱(Gas chromatography,GC)分析[19]。

1.2.3.2 GC检测条件 HP-88氰丙基色谱柱(30 m×0.25 mm,0.20 μm);载气:H2;不分流进样;进样量1 μL;检测温度220 ℃;程序升温:起始柱温设定为70 ℃,以15 ℃/min升至120 ℃,保持1 min,再以5 ℃/min升至175 ℃,保持10 min;最后以5 ℃/min升至220 ℃,保持5 min。采用峰面积归一化法求得样品中脂肪酸的相对百分含量。

1.2.4 挥发性风味物质测定 固相微萃取(Solid-phase microextraction,SPME)处理:取3 g样品放入顶空进样瓶中,并用硅胶垫片与铝圈密封,在60 ℃条件加热10 min后将老化后的50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(DVB/CAR/PDMS)涂层萃取头插入进样瓶,于60 ℃条件下吸附30 min后取出萃取头,并立即将其插入GC进样口中,250 ℃解吸3 min后取出,用于GC-MS分析测定。GC条件:TR-35 MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm);载气:高纯氦气;进样模式:不分流;进样口温度:250 ℃;升温程序:柱初温40 ℃,保持3 min,以5 ℃·min-1升至90 ℃,而后以10 ℃·min-1升至230 ℃,保持7 min。MS条件:传输线温度250 ℃;检测器温度280 ℃;离子源(EI)温度 200 ℃;电子能量70 eV;质量扫描范围m/z 30～500。

1.3 数据处理

将所得GC-MS数据置于NIST 2.0谱库中做自动检索分析,且仅当正反匹配度(SI/RSI)均大于800(最大值为1000)的鉴定结果才予以保留[20]。本文相关测定数据以X±SD表示。采用SPSS 21.0统计软件包对各组数据进行显著性分析,P<0.05表示有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同脂溶性天然抗氧化剂抗氧化效果的比较

油脂的AV和POV值是反映其氧化程度,判断油脂品质好坏的重要指标[21]。AV是对油脂中游离羧酸基团个数计算的一种计量标准[22],其数值的大小与所含游离脂肪酸量多少密切相关。AV越大,表明氧化程度越高。在高温贮藏条件下,油脂受热易氧化导致其中酯键断裂而产生大量游离脂肪酸(FFA),从而造成AV过高。由图1(a、b、c)可知,未添加抗氧化剂的甲鱼油(空白对照组)中AV明显升高,而三组实验组中AV增长速率缓慢,且不同添加量的作用效果也有所差异,这说明抗氧化剂能够有效防止油脂氧化酸败,延长其保存期限[7]。贮藏初期(前4 d),在同种抗氧化剂的不同添加量作用下,甲鱼油AV的变化趋势相近,这是由于甲鱼油正处于氧化诱导阶段,稳定性较好[23]。甲鱼油初始AV为1.05 mg/g,在高温贮藏第4 d,空白对照组中AV已超过鱼油行业标准SC/T 3502-2016[24]中规定的一级甲鱼油AV标准8 mg/g,而三组实验组中则在第8 d才完全超过一级标准值,这说明LTP、LRO、VE能有效地减缓油脂氧化速率。如图1a所示,0.06%LTP的抗氧化作用最佳,0.08%次之,0.02%最弱,该结果与余琼瑶等[25]报道的实验结果相近。如图1b所示,LRO添加量为0.04%时,抗氧化效果最好,0.02%、0.08%、0.06%依次增强;如图1c所示,VE的抗氧化作用随添加量的增加而增强,即添加量为0.08%时,VE的抗氧化性最强,AV最小。朱雪梅等[14]研究的结果与本实验相近,即VE的添加量越多,油脂抗氧化性越好。

图1 不同添加量的LTP、LRO、VE对甲鱼油酸价和过氧化值影响Fig.1 Effect of different addition of LTP,LRO and VE on the acid value and peroxidation value of turtle oil注:a,d分别为添加LTP鱼油的酸价和过氧化值;b,e分别为添加LRO鱼油的酸价和过氧化值；c,f分别为添加VE鱼油的酸价和过氧化值。

POV值主要反映油脂中氢过氧化物的含量,常与AV值协同判定油脂品质[25]。氢过氧化物是油脂氧化产生的初级氧化产物。油脂长时间置于高温条件下,易导致其氧化作用加剧,POV升高,且在氧化过程中,氢过氧化物的分解速率与其生成速率之间的关系也会影响POV的变化规律。另外,氢过氧化物能被进一步分解成小分子酮、醛类等次级氧化产物[23]。而脂溶性天然抗氧化剂(LTP、LRO、VE)的添加能有效地减弱甲鱼油中的氧化作用,结果如图1(d、e、f)所示。由图1(d、e、f)可知,四组样品中POV的变化趋势与AV相似。甲鱼油中所含的多不饱和脂肪酸(PUFA),在高温条件下,极易被氧化而分解、异构化[26-27],且氧化会不断进行,直至PUFA中所含双键完全消失[28]。总体来看,三组实验组中POV在贮藏第4 d全部超过鱼油行业标准SC/T 3502-2016[24]中规定的一级甲鱼油的POV标准6 mmol/kg,而空白组则在第2 d就已超过一级标准值。

由图2可知,将添加量分别为0.06%、0.04%、0.08%的LTP、LRO、VE进行抗氧化性能比较,发现在贮藏初期(前4 d),三组的AV与POV几乎相同,随贮藏时间的延长,0.04%添加量的LRO抗氧化效果最强,0.06%添加量的LTP次之,而0.08%添加量的VE抗氧化作用最弱。不同抗氧化剂的最佳抗氧化添加量不同,这可能与抗氧化剂本身所含有的有效成分含量多少有关,或者与有效成分吸收自由基的能力相关[29]。

图2 不同最佳添加量的LTP、LRO、VE对甲鱼油酸价和过氧化值影响Fig.2 Effect of LTP,LRO and VE on acid value and peroxidevalue of turtle oil with different optimal addition amounts

2.2 不同脂溶性天然抗氧化剂对甲鱼油挥发性成分的影响

随着贮藏时间延长,甲鱼油中不良气味显增强,其挥发性成分主要由醛、醇、酮、酸和呋喃类等物质组成,甲鱼油中的挥发性风味成分主要有壬醛、己醛、苯甲醛、1-戊烯-3-醇、己醇、乙酸、丁酸、2-壬酮、2-庚酮和2,5-二甲基呋喃,在贮藏过程中,变化显著,结果如图3所示。醛类化合物是不良风味的重要组成成分,主要来自不饱和脂肪酸的氧化降解,可表征油脂的氧化程度。醛类的感觉阈值一般很低,对整体风味贡献大[30];醇类化合物是由于脂肪酸二级氢过氧化物的降解或羰基化合物还原生成,可分为饱和醇类与不饱和醇类[20]。相比之下,不饱和醇类的感觉阈值更低,对整体风味贡献更大[31];酮类化合物的产生机制与醛、醇类化合物类似,主要通过油脂中氢过氧化物热氧化降解产生[32];而烃类化合物则可能是由于烷基自由基的自氧化作用产生,各种烃类(C8～C20)的感觉阈值通常较高,对鱼油整体风味几乎没有作用[33-34]。

由图3可知,在贮藏前期(前4 d),挥发性成分的含量增长速率缓慢,这与不同抗氧化剂处理的甲鱼油的AV及POV在贮藏前期的变化规律趋近。到贮藏中期(4～8 d),由于脂肪酸氧化加剧导致挥发性氧化产物大量增加。在整个贮藏期间,壬醛的含量变化最为明显。壬醛是油酸氧化的主要特征产物,且感觉阈值为1 μg/kg,对鱼油整体风味贡献很大,主要赋予甲鱼油脂肪味[33]。1-戊烯-3-醇是鱼油中重要的不饱和醇类化合物,可作为评价鱼油氧化程度的参考化合物,且具有鱼腥味等特征风味[34],其含量变化也较明显。己醛含量在贮藏后期(8～12 d)呈现指数型增长,己醛是亚油酸氧化的重要特征产物[35]。另外,2-壬酮、2-庚酮及2,5-二甲基呋喃的含量都有明显增加,且阈值低,对鱼油整体风味贡献大。而乙酸、丁酸含量的增加可表征油脂氧化酸败剧烈程度[36],在贮藏后期,乙酸与丁酸的含量显著升高,说明该甲鱼油氧化酸败严重。

图3 未添加抗氧化剂时甲鱼油主要挥发性成分随贮藏时间的变化Fig.3 Changes of main volatile flavor components ofturtle oil with storage time under no antioxidant addation

2.2.1 不同添加量的LTP对甲鱼油挥发性成分的影响 在贮藏过程中,添加量分别为0.02%、0.04%、0.06%、0.08%的LTP对甲鱼油主要挥发性成分影响的结果如图4所示。

图4 不同添加量的LTP对甲鱼油主要挥发性成分影响Fig.4 Effect of LTP on the main volatile components of turtle oil with different amounts注:a、b、c、d分别表示添加量为0.02%、0.04%、0.06%、0.08%;图5、图6同。

图5 不同添加量的LRO对甲鱼油主要挥发性成分影响Fig.5 Effect of LRO on the main volatile components of turtle oil with different amount

图6 不同添加量的VE对甲鱼油主要挥发性成分影响Fig.6 Effect of VE on the main volatile components of turtle oil with different amount

由图4可知,整个贮藏过程中,在不同添加量的LTP作用下,甲鱼油中10种主要挥发性化合物含量的变化趋势基本相同。在贮藏前期(前4 d),各物质含量变化不明显,此时鱼油正处于氧化诱导阶段,稳定性较好[37],而后期(8～12 d)因鱼油氧化酸败加剧,壬醛、己醛、1-戊烯-3-醇、乙酸、丁酸的含量显著升高。在添加量为0.06%时,LTP的抗氧化性最强,该实验结果与余琼瑶等[25]报道的LTP在添加量为100～200 mg/kg时抗氧化效果最好的结论相一致。LTP四种不同添加量的抗氧化能力如下:0.06%>0.08%>0.04%>0.02%。

2.2.2 不同添加量的LRO对甲鱼油挥发性成分的影响 在贮藏过程中,添加量分别为0.02%、0.04%、0.06%、0.08%的LRO对甲鱼油主要挥发性成分影响的结果如图5所示。

由图5可知,分别在添加量为0.02%、0.04%、0.06%、0.08%的LRO作用下,甲鱼油中主要挥发性成分含量变化趋势与LTP相近。在整个贮藏过程中,苯甲醛、己醇、2-壬酮、2,5-二甲基呋喃与2-庚酮含量的变化趋势较为明显,且在第4 d,2,5-二甲基呋喃的含量最少,而2,5-二甲基呋喃主要是由亚麻酸分解产生的,阈值较高,对整体风味作用小[34]。LRO四种不同添加量的抗氧化能力如下:0.04%>0.06%>0.08%>0.02%。该结果与杨磊等[38]报道的相一致。

2.2.3 不同添加量的VE对甲鱼油挥发性成分的影响 在贮藏过程中,浓度不同的VE在油脂中的抗氧化效果有明显差异。添加量分别为0.02%、0.04%、0.06%、0.08%的VE对甲鱼油主要挥发性成分影响的结果如图6所示。

由图6可知,在贮藏第6 d,壬醛的含量显著增加,且VE添加量为0.02%时,壬醛的变化量最大,说明该添加量下,VE的抗氧化效果最差。随着添加量的不断增加,VE抗氧化性也在不断增强。在整个贮藏过程中,添加量为0.08%的VE抗氧化性最强,甲鱼油中主要挥发性成分的含量变化最小。VE四种不同添加量的抗氧化能力如下:0.08%>0.06%>0.04%>0.02%。

2.3 不同脂溶性天然抗氧化剂对甲鱼油脂肪酸组成的影响

通过研究三种抗氧化剂的不同添加量对甲鱼油AV、POV及挥发性成分的作用效果,得出LTP、LRO、VE最佳添加量分别为0.06%、0.04%、0.08%。为了进一步探究三种抗氧化剂添加量为最佳时的抗氧化效果差异,故分别测定未添加抗氧化剂和在0.06% LTP、0.04% LRO、0.08% VE作用下的甲鱼油中脂肪酸组成及相对含量。未添加抗氧化剂的甲鱼油中脂肪酸测定结果如图7所示。

图7 甲鱼油样品气相色谱图Fig.7 The representative gas chromatographicprofile of FAMEs in the turtle oil

由图7可知,甲鱼油中检测出约14种重要脂肪酸,主要为C14～C22,且出峰时间在6～23 min。甲鱼油主要脂肪酸有肉豆蔻(C14∶0)、十五酸(C15∶0)、棕榈酸(C16∶0)、十七酸(C17∶0)、十七碳一烯酸(C17∶1)、硬脂酸(C18∶0)、油酸(C18∶1 cis)、亚油酸(C18∶2 cis)、花生四烯酸(C20∶4)、EPA和DHA[39],其相对含量如表1所示。由表1可知,饱和脂肪酸(Saturated fatty acid,SFA)SFA、单不饱和脂肪酸(Monounsaturated fatty acid,MUFA)、PUFA的总含量分别为31.02%、49.77%、19.21%。其中,C18∶1 cis是一种具有良好生理活性的MUFA[34]。有研究报道,长期食用富含油酸的食物能有效降低Ⅱ型糖尿病患病风险[40],甲鱼油中油酸含量最高,C16∶0次之,C17∶1含量最少,且∑EPA+DHA为11.12%。

表1 不同抗氧化剂作用下甲鱼油中主要脂肪酸相对含量的变化(%)Table 1 Changes of relative contents of main fatty acids in turtle oil under different antioxidants(%)

此外,在0.06% LTP、0.04% LRO、0.08% VE作用下的甲鱼油中脂肪酸相对含量的结果如表1所示,在整个贮藏期间,未添加抗氧化剂的甲鱼油,即空白组中脂肪酸变化最为显著。贮藏后,空白组中∑SFA、∑MUFA分别增加了30.05%和3.32%,而∑PUFA则下降了57.11%,其中∑EPA+DHA减少了37.95%。鱼油中PUFA较MUFA更易被氧化,其减少速率比MUFA快,而MUFA氧化成为SFA的速率又相对较慢,故使得MUFA占比增大。该结果与李文佳[37]研究鱼油贮藏过程中脂肪酸变化的趋势相接近,即整个贮藏过程中,甲鱼油中SFA总含量增加而导致整体不饱和度下降。此外,分别在0.06% TLP、0.04% LRO及0.08% VE三种不同浓度的抗氧化剂作用下,甲鱼油的氧化速率明显减小,能有效地保护甲鱼油中的活性成分,最终∑EPA+DHA分别为9.04%、9.07%、8.92%,下降率分别仅为18.71%、18.44%、19.78%。从该实验结果可以预测出三种抗氧化剂添加量为最佳时的抗氧化能力如下:0.04% LRO>0.06% LTP>0.08% VE。

3 结论与讨论

本文采用的LTP、LRO及VE这三种天然抗氧化剂对甲鱼油贮藏过程中脂质氧化具有显著的抑制效果,不同抗氧化剂的最佳添加量存在差异,且抗氧化效果有较大不同。通过测定甲鱼油中AV、POV及挥发性成分的变化,得出LTP、LRO、VE三者的最佳添加量分别为0.06%、0.04%、0.08%;并在最佳添加条件下,通过比较三种甲鱼油中脂肪酸含量变化的差异,可得抗氧化能力关系如下:0.04% LRO>0.06% LTP>0.08% VE。该实验结果可为其今后在实际生产中进一步的研究与开发提供理论基础。但本研究中尚未对这三种不同脂溶性天然抗氧化剂的结构进一步分析,抗氧化剂结构的差异可能会造成其抗氧化效果的不同。在后续实验中,将通过对抗氧化剂结构的分析更加深入地研究讨论其抗氧化原理,并建立油脂氧化动力学反应模型建立,预测货架期。