巨大芽孢杆菌LB01对采后芒果炭疽病菌的抑制机制初探

丁从文,冯 群,李春焕

(1.桂西区域生态环境分析和污染控制重点试验室,广西百色 533000; 2.百色学院化学与环境工程学院,广西百色 533000)

芒果营养成分丰富,不仅富含膳食纤维和维生素C,还含有高含量的维生素A前体β-胡萝卜素和和类胡萝卜素[1]。芒果炭疽病是影响芒果营养、品质及市场价值的重要采后病害[2]。目前,芒果炭疽病控制仍然依赖于化学杀菌剂,但长期使用会造成病原抗药、环境污染和健康风险[3]。利用细菌、酵母菌等微生物防治作为可以替代化学杀菌剂防治的新手段已被广泛研究[4-5]。

拮抗细菌已被发现可有效控制果蔬采后病害[6-9]。芽孢杆菌属(Bacillus)是常见的拮抗细菌属,巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)是芽孢杆菌属(Bacillus)的一个种,许多研究表明巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)对一些食品病原菌,如魔芋软腐病菌,青枯雷尔氏菌,番茄灰霉病原菌,香蕉灰斑病菌,花生黄曲霉菌等均有一定抑制作用[10-14]。

本文将首次研究源于百色岩溶区的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)LB01对采后芒果炭疽病菌的抑制作用,并着重阐明其对采后芒果炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)的抑菌机制,为巨大芽孢杆菌菌株发酵液防治采后芒果炭疽病菌的作用机理的进一步深入研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)菌株 百色市凌云县岩溶区芒果园根际土壤,分离鉴定后保存于桂西区域生态环境分析与污染控制重点实验室芽孢杆菌菌株储藏室(菌株编号为LB01);炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides) 百色学院大型真菌研发中心提供;七至八成熟“金煌”芒果 百色市凌云县岩溶区芒果实验果园;PI(碘化丙啶)、DCHF-DA(2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯)、MitoTracker® Orange CMTMRos生物染色剂(BS) 上海恒远生物科技有限公司;DMSO(二甲基亚砜)、TBA(硫代巴比妥酸) 分析纯(AR)济南恒化科技有限公司。

MF20-3微孔膜过滤器 海宁市中力过滤设备厂;Countess II FL全自动细胞计数仪 英潍捷基(上海)贸易有限公司;FYL-YS-280L中型恒温冷藏箱 北京福意电器有限公司;WDZX-300KC卧式压力蒸汽灭菌锅 广州瑞丰实验设备有限公司;OLB-211B恒温摇床振荡器 济南来宝实验室设备有限公司;TGL-16M高速冷冻离心机 上海聚莱实验仪器有限公司;Axioskop 40蔡司荧光显微镜、Axiocam MRC 10数码相机 德国奥伯科兴卡尔蔡司公司;V-1200分光光度计 上海美谱达仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 芒果果实的处理 芒果果实未受到任何损伤与感染,根据芒果果实的体积大小进行分类,然后采用1%(v/v)的NaClO溶液对选择好的芒果进行表面消毒2 min,利用无菌蒸馏水进行洗涤,使用前于通风处进行风干。

1.2.2 培养基的配制 马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基、马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)培养基及溶菌酶肉汤(LB)培养基配方见《微生物学实验技术》[15]。

1.2.3 巨大芽孢杆菌LB01菌株发液的制备 菌株LB01经活化后倒入LB液体培养基中,以180 r/min的转速于摇床上36 ℃恒温培养48 h,收集菌株发酵液,11000×g离心6 min后,取上清液经孔径为0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌,收集无菌发酵滤液置于0～4 ℃冰箱储存备用。

1.2.4 炭疽病菌孢子悬浮液的制备 将炭疽病菌(C.gloeosporioides)于PDA培养基25 ℃培养7～14 d,采用无菌去离子水冲洗培养物,用无菌玻璃棒摩擦孢子,再经双层纱布过滤,孢子悬浮液用1～4 mL无菌去离子水稀释并借助细胞计数仪调节浓度至1.0×104conidia/mL。

1.2.5 巨大芽孢杆菌LB01菌株对采后芒果发病率及病斑扩展的影响 参考李春玲等[16]报道的测定方法,采用一枚无菌针于芒果果实腰部产生直径为4.0 mm、深度为2.5 mm的伤口,然后将其浸在1.5 L LB01菌株发酵滤液中,等体积的无菌蒸馏水代替LB01菌株发酵滤液作为对照。50 min后取出芒果,于通风处自然风干2 h后,于每个芒果果实的伤口中心注入3 μL炭疽病菌孢子悬浮液(1.0×104conidia/mL),所有供试芒果均在25 ℃恒温储存。储存0、7和10 d测定LB01菌株发酵滤液对芒果果实的发病率及病斑直径的影响。每处理15个芒果果实,重复3次,整个实验重复2次。

1.2.6 巨大芽孢杆菌LB01菌株对菌丝生长的影响 采用文献[17]报道的测定方法,将3.0 μL LB01菌株发酵滤液加到80 mL熔化的PDA培养基中配成含药培养基,用无菌打孔器(d=5 mm)在生长8 d的菌落边沿打孔,然后将菌饼接种于含药培养基中央,用保鲜保湿膜密封并于25 ℃恒温培育24、36、48、72、96和120 h。用无菌蒸馏水代替LB01菌株发酵滤液作为对照。测定LB01菌株发酵滤液对芒果炭疽病菌菌丝生长的抑制作用。每次处理重复3次,整个实验重复2次。

1.2.7 巨大芽孢杆菌LB01菌株对孢子萌发及芽管伸长的影响 根据文献[13]描述的测定方法,将100 μL孢子悬浮液(1.0×104conidia/mL)、1.2 mL PDB培养基和3.0 μL LB01菌株发酵滤液加到2.5 mL离心管中。取150 μL混合液均匀涂在载玻片上,然后将其置于底部铺有圆形湿润滤纸的培养皿中,于25 ℃恒温培育6、8、10和12 h。用无菌蒸馏水代替LB01菌株发酵滤液作为对照。测定LB01菌株发酵滤液对芒果炭疽病菌孢子萌发及芽管伸长的抑制作用。每次处理至少检查300个孢子,每个处理均重复3次,整个实验重复2次。

1.2.8 巨大芽孢杆菌LB01菌株对活性氧(ROS)水平的影响 根据Shi等[18]报道的ROS水平的测定方法,采用氧化剂敏感探针2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCHF-DA)测定炭疽菌细胞内活性氧(ROS)水平。将300 μL炭疽菌孢子悬浮液(1.0×104conidia/mL)加到3 mL含有3.0 μL LB01菌株发酵滤液的PDB培养基中,恒温摇床(25 ℃,200 r/min)振荡培养,用无菌蒸馏水代替B01菌株发酵滤液作为对照。分别于6、12和18 h后取出10 μL孢子液于0～4 ℃离心(5000 r/min)10 min,采用10 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH=7.0)洗涤,并在含有10 μmol/L DCHF-DA(溶于二甲基亚砜)的相同缓冲液中避光孵育5 min。于蔡司荧光显微镜下观察,并计算每次处理中被DCHF-DA染色的孢子细胞百分比(%)。每个处理重复两次,整个实验重复3次。

1.2.9 巨大芽孢杆菌LB01菌株对丙二醛(MDA)含量的影响 根据Wang 等[19]报道的MDA含量的测定方法,将30 μL炭疽病菌的孢子悬浮液(1.0×104conidia/mL)加到100 mL PDB培养基中,混匀后于25 ℃以200 r/min的转速在摇床上培养3 d后收集菌丝体。取2 g菌丝体置于含有100 mL PDB培养基的锥形瓶中,加入30 μL LB01菌株发酵滤液,混匀后于200 r/min 25 ℃恒温摇床离心培养0、6、12和18 h,吸取上清液1 mL加入2 mL 0.5%硫代巴比妥酸(TBA)溶液,混匀后于95 ℃恒温加热20 min,迅速于冰浴上冷却5 min,然后12000×g离心10 min,于600和532 nm波长下测定吸光度。等体积的无菌蒸馏水代替LB01菌株发酵滤液作对照。每个处理有3次重复,整个实验重复2次。按照下列公式算出MDA浓度C(nmol/mL),再换算出单位质量菌丝中MDA含量(nmol/mg)。

式中:C表示根据吸光度值计算出的溶液摩尔浓度,nmol/mL;A532和A600分别表示样品中MDA-TBA反应产物在532和600 nm波长处的吸光度值;E表示样品中MDA-TBA反应产物的消光系数,mmol/cm;L表示比色皿厚度,cm。

1.2.10 巨大芽孢杆菌LB01菌株对线粒体分布的影响 采用Shi等[18]报道的线粒体分布的测定方法,检测LB01菌株发酵滤液对炭疽病菌孢子中线粒体分布的影响。将300 μL炭疽病菌孢子悬浮液(1.0×104conidia/mL)加到3 mL含有3.0 μL LB01菌株发酵滤液的PDB培养基中,恒温摇床(25 ℃,200 r/min)培养,用等体积无菌蒸馏水代替LB01菌株发酵滤液作为对照。25 ℃培养2、6、12和18 h后取出15 μL孢子液,加入0.1 μL线粒体选择性染色剂(MitoTracker® Orange CMTMRos),对孢子线粒体染色5 min,采用蔡司荧光显微镜观察拍照,每次处理至少检查20 个孢子,重复3次。

1.2.11 巨大芽孢杆菌LB01菌株对细胞膜完整性的影响 采用黄云坡等[20]报道的细胞膜完整性的测定方法,将200 μL炭疽菌孢子悬浮液(1.0×104conidia/mL)加到2 mL含有3.0 μL LB01菌株发酵滤液的PDB培养基中,恒温摇床(27 ℃,190 r/min)振荡培养(用等体积的无菌蒸馏水代替LB01菌株发酵滤液作为对照),分别于6、12和18 h后取出15 μL孢子液于4 ℃离心(5000 r/min)15 min,采用10 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH=7.0)洗涤2 次,加入10 μmol/L碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)染色剂进行染色,通过蔡司荧光显微镜观察,采用数码相机拍照。每个样本随机选取3个视野,并将亮场中的孢子数定义为总数。每个处理重复3次,整个实验重复2次。膜完整性(Membrane integrity,MI)用以下公式计算。

式中:MI表示孢子细胞膜完整性,%;Fn表示荧光场中的孢子数;Bn表示明亮场中的孢子数。

1.3 数据处理

所有统计学分析软件均使用SPSS 11.5版(SPSS公司,美国芝加哥)进行,通过单因素方差(ANOVA)进行分析。平均值偏离数由Duncan的多范围测试进行。相关生化指标测定值的差异分别被界定为显著性差异(P<0.05)与极显著性差异(P<0.01)。

2 结果和分析

2.1 巨大芽孢杆菌LB01菌株对采后芒果发病率及病斑扩展的影响

由图1A可知,接种后储存7和10 d,对照组芒果果实发病程度严重,而LB01菌株发酵滤液处理7和10 d后芒果果实发病程度轻微;由图1B可知,接种后储存7 d时,对照组芒果果实已完全发病,而LB01菌株发酵滤液处理7 d后芒果果实发病率仅为46.8%;由图1C可知,接种后储存7、10 d时,对照组芒果果实病斑直径分别扩展至28.33和66 mm,而LB01菌株发酵滤液处理7和10 d后芒果果实病斑直径分别仅为5.67和15 mm,病斑直径分别减少79.98%和77.12%。由此可见,巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)LB01菌株发酵滤液能显著抑制采后芒果发病率及病斑扩展。

图1 B. megaterium LB01的体内抑菌效应Fig.1 Anti-fungal effect of B. megaterium LB01 against C. gloeosporioides in vivo注:A.芒果果实炭疽病的症状;B.芒果发病率随处理时间的改变情况;C.芒果病斑直径随处理时间的改变状况;**表示同一时间点对照组与处理组测定值存在极显著差异(P<0.01)。

2.2 巨大芽孢杆菌LB01菌株对菌丝生长及孢子萌发的影响

如图2A所示,培养120 h,对照组炭病疽菌菌丝颜色仍然保持白色,而LB01菌株发酵滤液处理96 h后,菌丝颜色则已变灰;由图2B可知,培养96 h,对照组菌落(colony diameter)直径已达12.62 mm,而LB01菌株发酵滤液处理120 h后菌落直径仅为8.56 mm。由此可见,巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)LB01菌株发酵滤液能显著抑制采后芒果炭疽菌的菌丝生长。

图2 B. megaterium LB01对炭疽病菌菌丝生长的影响Fig.2 Effect of B. megaterium LB01 on mycelialgrowth of C. gloeosporioides in vitro注:A.炭疽病菌的体外症状;B.炭疽病菌的菌落直径;**表示同一时间点对照组与处理组测定值具有极显著差异(P<0.01)。

如图3A所示,培养8 h,对照组已有93.31%的孢子萌发(conidial germination),而LB01菌株发酵滤液处理10 h后孢子仅有86.37%萌发;由图3B可知,培养6 h,对照组芽管长度(germ tube length)已达121.22 μm,而LB01菌株发酵滤液处理8 h后芽管长度仅为103.16 μm。由此说明,巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)LB01菌株发酵滤液能显著抑制采后芒果炭疽菌的孢子萌发和芽管伸长。

图3 B. megaterium LB01对炭疽病菌孢子萌发及芽管长度的影响Fig.3 Effects of B. megaterium LB01 on spore germinationand germ tube length of C. gloeosporioides in vitro注:A.孢子萌发率;B.芽管长度;*表示同一时间点对照组与处理组测定值存在显著差异(P<0.0 5)。

2.3 巨大芽孢杆菌LB01菌株对炭疽菌孢子ROS水平的影响

利用氧化剂敏感探针(DCFH-DA)对炭疽菌孢子细胞内活性氧(ROS)实行染色,染色率测定的结果如图4显示。在培养至第6和12 h后,处理组有73.24%和84.31%的孢子已被DCFH-DA染色剂染色,而对照组染色率分别仅为65.25%和72.23%,平均低于处理组测定值约10个百分点。这些数据测定结果表明,巨大芽孢杆菌(B.megaterium)LB01菌株发酵滤液能显著诱导炭疽菌(C.gloeosporioides)孢子内活性氧(ROS)的产生与积累。

图4 B. megaterium LB01对炭疽病菌孢子活性氧产生的影响Fig.4 Effects of B. megaterium LB01 on the generation ofROS in spores of C. gloeosporioides注:*和**分别表示对照组与处理组测定值具有显著性差异(P<0.05)和极显著性差异(P<0.01)。

2.4 巨大芽孢杆菌LB01菌株对炭疽菌MDA含量的影响

由图5可知,接种后培养6 h后,处理组MDA含量已经高达0.78 nmol/mg,而对照组培养12 h后MDA含量仅为0.62 nmol/mg;接种后培养0 h时,对照组与处理组的MDA含量均为0.52 nmol/mg,但培养6 h时,对照组MDA含量升高至0.61 nmol/mg,而处理组MDA含量却加速升高至0.78 nmol/mg。处理组MDA 含量的显著升高表明细胞内部已受到ROS的严重氧化损伤。

图5 B. megaterium LB01对炭疽病菌中MDA含量的影响Fig.5 Effects of B. megaterium LB01 on theMDA content of C. gloeosporioides注:*表示同一时间点对照组与处理组病原菌测定值具有显著性差异(P<0.05)。

2.5 巨大芽孢杆菌LB01菌株对炭疽菌孢子中线粒体分布的影响

采用线粒体选择性染色剂(MitoTracker® Red CMTMRos)对病原菌孢子内线粒体进行染色,处理结果如图6所示。对照组孢子中有大量的线粒体均匀出现在整个细胞内间隙中,发出一定强度的荧光,12、18 h后孢子荧光没有显著改变。但经LB01菌株发酵滤液处理12 h后,孢子荧光强度变得微弱,孢子内线粒体分布集中且不均匀,处理18 h后,处理组孢子内的荧光已经非常微弱,此刻大多数线粒体可能因降解而损坏。

图6 B. megaterium LB01对炭疽病菌孢子中线粒体分布的影响Fig.6 Effect of B. megaterium LB01 on thedistribution of mitochondria in spores of C. gloeosporioides注:孢子于25 ℃培养,棒子表示10 μm。

2.6 巨大芽孢杆菌LB01菌株对炭疽菌孢子膜完整性的影响

基于图7A中的碘化丙啶(PI)对孢子的染色结果,可以断定,经B.megateriumLB01菌株发酵滤液处理的孢子细胞膜完整性(membrane integrity)受到严重破坏,PI染色率显著高于对照组;由图7B可知,培养6、12和18 h后,对照组孢子细胞膜完整性分别已达98.32%、84.23%和65.34%,而LB01菌株发酵滤液处理6、12和18 h后孢子细胞膜完整性分别仅为73.21%、68.31%和43.18%。由此说明,B.megateriumLB01对炭疽菌(C.gloeosporioides)孢子细胞膜具有显著的破坏作用。

图7 B. megaterium LB01对炭疽病菌孢子细胞膜完整性的影响Fig.7 Effects of B. megaterium LB01 on the membrane integrity of spores of C. gloeosporioides注:*和**分别表示对照组与处理组测定值具有显著性差异(P<0.05)和极显著性差异(P<0.01)。

3 讨论与结论

近年来,国内外许多学者研究发现一些芽孢杆菌属细菌,如解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)DGA14[21]、荧光假单胞杆菌(fluorescensMigula)A1[22]和芽孢杆菌属(Bacillusspp.)LB72[23]对采后芒果炭疽病菌(C.gloeosporioides)均具有一定的抑制作用。但是,关于巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)对芒果炭疽病菌(C.gloeosporioides)的抑制作用及其作用机理的报道,相关文献极其甚少。本文研究了芽孢杆菌属细菌巨大芽孢杆菌(B.megaterium)LB01菌株发酵滤液对采后芒果炭疽病菌的抑菌效果,并对其抑制作用机理进行了初步探究。

与对照组相比,处理组B.megateriumLB01对芒果采后炭疽病的发病率和发病程度均有显著的影响,表明LB01菌株发酵滤液对采后芒果果实炭疽病具有较强的抑制效果。体外培养的C.gloeosporioides经巨大芽孢杆菌LB01的处理,C.gloeosporioides的菌丝生长、孢子萌发及芽管伸长均均受到显著抑制。C.gloeosporioides细胞内活性氧(ROS)水平、丙二醛(MDA)含量及线粒体分布状况和降解程度均是影响炭疽病原菌生长及孢子萌发的重要指标。

活性氧(ROS)能对细胞中的化合物造成氧化损伤,并导致细胞功能障碍甚至细胞死亡[24-25]。在所有细胞中,ROS的产生和清除之间存在着适当的细胞内平衡。氧化还原动态平衡要求不同细胞间反应的有效协调,并受复杂的信号传导路径控制[26]。活性氧(ROS)是呼吸作用常见的产物之一,但其产生与积累至一定程度,除了可破坏细胞内平衡,还可与细胞内生物大分子(脂质、蛋白质及DNA)反应,最终导致细胞凋亡[27-28]。本研究的炭疽菌经LB01菌株发酵滤液处理6、12 h后,孢子内活性氧(ROS)水平显著升高,说明巨大芽孢杆菌LB01菌株发酵滤液能诱导孢子内活性氧大量产生而对菌丝造成损伤直至死亡;丙二醛(MDA)是细胞内部生物大分子(如脂质)过氧化的产物,它是细胞内部生物大分子氧化损伤程度一个重要指标[29],本研究采用巨大芽孢杆菌LB01菌株发酵滤液处理6 h后,MDA含量显著升高,此时细胞内部 MDA 的含量是对照值的1.5倍,MDA含量的显著升高暗示病原菌菌丝细胞内部已受到严重的氧化损伤,最后导致细胞死亡。

因此,巨大芽孢杆菌LB01菌株发酵滤液能显著诱导炭疽菌孢子内活性氧(ROS)的产生和积累及促进菌丝中丙二醛(MDA)含量的升高,表明菌丝和孢子细胞内脂质、DNA和蛋白质可能已经受到严重的氧化损伤,从而抑制病原菌孢子萌发和菌丝生长,这可能是巨大芽孢杆菌LB01抑制采后芒果炭疽病菌生长从而防治采后芒果炭疽病的机制之一。

众所周知,线粒体是细胞三磷酸腺苷(ATP)的主要来源,在多种细胞代谢和细胞凋亡等过程中起着核心作用[30-31],本研究显示巨大芽孢杆菌LB01菌株发酵滤液处理后炭疽菌(C.gloeosporioides)孢子内线粒体荧光变暗,表明巨大芽孢杆菌LB01对线粒体具有一定的损伤作用,可能导致活性下降,对细胞正常的新陈代谢活动造成一定的影响。同时,线粒体呼吸活动也是ROS的主要内生源,ROS大量产生和积累不仅可引起线粒体DNA(mtDNA)突变、衰老和细胞凋亡[32-33],还可引起线粒体电子传递信息中断,从而进一步促使线粒体内ROS的产生[34-35],二者交替进行,最后造成细胞凋亡。本研究表明,炭疽菌孢子内线粒体在经B.megateriumLB01发酵滤液处理后,荧光微弱、分布集中且严重降解,从而导致C.gloeosporioides孢子线粒体的氧化损伤。因此,病原菌孢子的活性氧(ROS)积累和线粒体降解可能是B.megateriumLB01抑制C.gloeosporioides生长的重要方式之一,从而抑制采后芒果果实炭疽病的发生。

在本研究中,芒果果实活体接种7和10 d后,经巨大芽孢杆菌LB01发酵滤液处理的芒果果实颜色仍呈黄色,但对照组已变为橙色,这表明巨大芽孢杆菌LB01在芒果采后衰老控制中起重要作用。相关文献报道芒果是一种对乙烯敏感的更年期水果,在衰老过程中呼吸作用与乙烯产生均显著增加[36],乙烯在植物种子萌发、植物生长、果实成熟、器官脱落和衰老以及抗病性等生理过程中起着重要作用[37]。本研究的巨大芽孢杆菌LB01菌株发酵滤液可能抑制了芒果果实中乙烯的产生或阻止乙烯与炭疽菌受体的结合,减少芒果腐烂,使芒果果实炭疽病的症状降低。而对照组芒果体内乙烯自由释放以致芒果后熟与衰老加快。因此,延缓芒果果实衰老也可能是巨大芽孢杆菌LB01抑制采后芒果炭疽病害的另一机制。

综上所述可以得出,本研究证实了从广西凌云县岩溶区芒果根边候选土壤中分离的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)LB01菌株发酵滤液通过直接抑制C.gloeosporioides孢子萌发和菌丝生长,从而抑制芒果采后炭疽病的发生。本研究结果为B.megateriumLB01对病原菌的抑制作用提供了一个机制框架,为芒果采后贮藏病害防治提供了一个较有前景的有效策略,为研发巨大芽孢杆菌(B.megaterium)LB01菌株防治采后芒果炭疽病的深层次作用机制奠定基础。