张弓老酒大曲中耐高温酵母菌的分离鉴定及发酵条件优化

刘延波,程莉莉,赵志军,候文静,潘春梅,*,孙西玉

(1.河南牧业经济学院食品与生物工程学院(酒业学院),河南郑州 450046; 2.河南牧业经济学院河南省白酒风格工程技术研究中心,河南郑州 450046; 3.河南牧业经济学院郑州市白酒酿造微生物技术重点实验室,河南郑州 450046; 4.张弓老酒酒业有限公司,河南宁陵 476733)

大曲是酿制传统白酒的糖化剂、发酵剂和增香剂,含有多种微生物,在酿造过程中起着重要的糖化、发酵和生香的作用,直接或间接影响白酒的产量、质量和风格[1]。浓香型白酒大曲的制作工艺为自然发酵,富集了原材料和环境中的微生物,微生物区系十分复杂[2]。酵母菌是白酒酿造微生物家族中不可或缺的一类微生物,从白酒制曲到酿造过程一直可以检测出,直接关系到产酒率[3]。

酵母菌种特性的要求是在高温、高渗、高糖、高pH、高酒精度等极端条件下仍具有较高的发酵能力。传统酿酒的酵母最适发酵温度为28～33 ℃[4],一般不超过36 ℃,但夏季生产时,室温在35～40 ℃之间,此时酵母菌的生长、繁殖、代谢均受到抑制,有些酵母菌甚至因不耐高温,出现死亡现象,这严重影响了夏季白酒生产的产量[5]。许多酒厂选择压排度夏,给生产带来极大的不便,更大大降低了设备和厂房等的利用率[6]。目前,耐高温酵母研究较多,但大都筛选自土壤[7-8],从大曲中筛选耐高温酵母的研究少有报道;因此,研究耐高温酵母菌株对白酒酿造和发酵工业具有重要的理论及实际意义。

本研究从张弓老酒中高温大曲中筛选出耐高温的酵母菌,并对该菌进行耐高温和耐乙醇性以及发酵性能测试和响应面法优化发酵条件,以期得到一株耐高温耐乙醇且高产酒精的酵母菌,为建立和开发中原浓香型白酒酵母菌菌种资源库提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

中高温大曲曲样 张弓老酒酒业有限公司;葡萄糖 天津市科密欧化学试剂有限公司;酵母粉、蛋白胨 英国Oxoid公司;KH2PO4、(NH)2SO4、MgSO4天津大学科威公司。

SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台 浙江孚夏医疗科技有限公司;DNP-9272BS-Ⅲ电热恒温培养箱 上海新苗医疗器械制造有限公司;LQZ-211恒温振荡培养箱 上海知楚仪器有限公司;LDZX-50KBS立式高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂;721分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司;H1850R高速离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制 富集培养基(豆芽汁培养基):称取新鲜黄豆芽100 g,置于烧杯中,再加入1000 mL水,小火煮沸30 min,用纱布过滤,补足失水,制成10%豆芽汁,再按每100 mL豆芽汁加入5 g葡萄糖,继续加热至葡萄糖溶化,补足失水,pH自然。分装、包扎,121 ℃灭菌20 min。

分离培养基(YEPD):蛋白胨20 g,酵母浸粉10 g,葡萄糖20 g,蒸馏水定容至1000 mL,pH自然,121 ℃下灭菌20 min。配制YEPD固体培养基时加入20 g/L的琼脂粉[9]。

发酵培养基:蛋白胨20 g,酵母浸粉10 g,葡萄糖100 g,硫酸镁1 g,硫酸铵1 g,磷酸二氢钾1 g,蒸馏水定容至1000 mL,pH自然,121 ℃下灭菌20 min[9]。

1.2.2 张弓老酒大曲中酵母菌的分离纯化 取大曲样品5 g,以无菌操作加入到195 mL富集培养基中加灭菌玻璃珠,于28 ℃,150 r/min,恒温摇床培养48 h。取富集菌液进行10倍梯度稀释,依次得到10-1～10-7的7个梯度稀释液。吸取10-5、10-6、10-7梯度稀释液各200 μL,均匀涂布于YEPD固体培养基平皿上,于28 ℃恒温培养箱培养48 h后,选取形态适宜的菌落通过美蓝染色法进行镜检,根据菌落特征及镜检确认为酵母菌后,挑取单菌落在YEPD固体培养基平皿上进行平板划线,得到单菌落后,与20%灭菌甘油按1∶1体积注入冻存管混匀,在-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 耐高温酵母菌的筛选 将每株保藏的菌种以相同接种量接种至装有10 mL YEPD液体培养基的试管中,于28 ℃,150 r/min,恒温摇床培养24 h。在超净工作台内,用接种环蘸取富集菌液一环在YEPD固体培养基平皿上进行平板划线,于45 ℃恒温培养箱培养,有菌落长出的平板对应菌株为耐高温酵母菌。

1.2.4 耐高温酵母菌的鉴定

1.2.4.1 形态学鉴定 将筛出的耐高温酵母菌在YEPD固体培养基上进行涂布,在28 ℃恒温培养箱培养48 h,记录耐高温酵母菌的基本形态特征,并通过美蓝染色法进行制片,然后进行显微镜观察。

1.2.4.2 分子生物学鉴定 26S rDNA序列分析:采用Ezup柱式酵母基因组DNA提取试剂盒提取分离菌株基因组DNA作为PCR反应的模板。基因扩增采用通用引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGG AAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′),反应体系为50 μL(SanTaqPCRMix预混液25 μL,引物各2 μL,DNA模板2 μL,ddH2O 19 μL)。PCR扩增条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 40 s,53 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,35个循环;最后72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳,将PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序,将测序所得到的特定序列,在NCBI上通过BLAST程序进行菌株同源性比对[10];最后用MEGA X 10.0.2软件构建系统发育树。

1.2.5 耐高温酵母菌的耐高温性研究 菌种活化后,吸取200 μL接种于9.8 mL的YEPD液体培养基,分别在温度为33、35、37、40、42、45、48 ℃的条件下静置培养24 h,通过OD660 nm值反映生长情况[11]。

1.2.6 耐高温酵母菌的耐乙醇性研究 菌种活化后,吸取200 μL分别接种于乙醇浓度为0、3%、6%、9%、12%的9.8 mL YEPD液体培养基试管中,在37 ℃静置培养24 h,通过OD660 nm值反映生长情况。

1.2.7 耐高温酵母发酵力测定 菌种活化后,吸取2 mL接种于98 mL发酵培养基中,在40 ℃下静置培养,每隔2 h测一次CO2失重量,记录发酵终止时间,并使用蒸馏-酒精计法测定发酵结束后发酵液的酒精度[12]。

1.2.8 单因素实验

1.2.8.1 温度 菌种活化后,吸取2 mL接种于pH自然、糖浓度为100 g/L的98 mL发酵培养基中,分别在温度为28、31、34、37、40、43 ℃的条件下静置培养72 h,通过CO2失重量反映发酵情况[13]。

1.2.8.2 pH 菌种活化后,吸取2 mL分别接种于糖浓度为100 g/L、pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的98 mL发酵培养基中,在最适发酵温度下静置培养72 h,通过CO2失重量反映发酵情况。

1.2.8.3 葡萄糖浓度 菌种活化后,吸取2 mL分别接种于最适pH、葡萄糖浓度为80、100、120、140、160、180 g/L的98 mL发酵培养基中,在最适发酵温度下静置培养72 h,通过CO2失重量反映发酵情况。

1.2.8.4 接种量 菌种活化后,分别吸取含有8%、10%、12%、14%、16%的上述菌液2 mL接种于在最适糖浓度和最适pH的发酵培养基中,在最适发酵温度下静置培养72 h,通过CO2失重量反映发酵情况。

1.2.9 响应面试验 根据单因素试验结果,进行方差分析选出三个显著性比较明显的三个因素[14];以发酵温度(A)、初始pH(B)、葡萄糖浓度(C)3个因素为自变量,将各自最优条件的范围编码为-1、0、1,响应面分析法的因素与水平表见表1,利用Design Expert 8.0.6软件设计Box-Behnken试验,确定耐高温酵母菌株的最佳发酵工艺参数组合并进行试验验证[15]。

表1 响应面分析法的因素与水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.3 数据处理

单因素试验结果均用平均值±标准差表示,利用Design Expert 8.0.6软件方差分析和设计BoxBehnken试验,建立模型并进行多元回归分析,所有实验均重复3次,实验数据处理以及显著性分析采用Excel 2010。

2 结果与分析

2.1 大曲中耐高温酵母菌的分离纯化

通过豆芽汁培养基富集培养,YEPD固体培养基划线分离,从大曲中筛出了100株酵母菌,又经45 ℃耐高温培养最终筛选出一株菌落形态较好的耐高温酵母菌,编号为ZG-3,如图1所示。菌株ZG-3呈白色,菌落为圆形,边缘整齐,表面光滑。

图1 ZG-3菌落图Fig.1 ZG-3 colony map

2.2 耐高温酵母菌的鉴定

2.2.1 形态学鉴定 制作美蓝染色涂片在显微镜下观察菌株ZG-3,结果如图2所示,菌体多呈卵圆形或圆形,并以芽殖的方式进行繁殖,存在单个或多个连接成串的菌体,结合菌落特征,可知ZG-3符合酵母菌形态[16]。

图2 ZG-3镜检图(100×)Fig.2 ZG-3 Microscopic view(100×)

2.2.2 分子生物学鉴定 将菌株ZG-3进行了PCR扩增,PCR扩增产物电泳图如图3所示。

图3 酵母菌26 S rDNA PCR扩增结果Fig.3 Yeast 26 S rDNA PCR amplification results注:M为DNA Marker,ZG-3为菌株。

经检测ZG-3长度在600 bp,这与酵母菌的D1/D2区域序列长度相符合,说明扩增正常。将测序所得到的特定序列,在NCBI上通过Blast程序进行同源性比较与分析,采用MEGA X 10.0.2软件中的邻接(neighbor joining,NJ)法构建系统进化树,结果见图4,确定其与库德里阿兹威毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)相似性达100%,因此确定菌株ZG-3为库德里阿兹威毕赤酵母。

图4 基于26S rDNA序列菌株ZG-3的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree of strain ZG-3 based on 26S rDNA sequence

2.3 耐高温酵母菌的性质研究

温度在酵母的生长及发酵过程中起至关重要的作用。从图5可得菌株ZG-3在YEPD液体培养基中33～37 ℃时对应的OD值呈上升趋势,在37～48 ℃时呈下降趋势,在37 ℃条件培养下菌体生长量最高,45 ℃时仍有菌体生长,而48 ℃时无菌体生长,因此菌株ZG-3的最适生长温度为37 ℃,最高生长温度为45 ℃。卜文静等筛选出耐高温酿酒酵母L-9a最高生长温度40 ℃[17];谭才邓等[18]筛选出一株耐高温高盐生香酵母菌PX-8,最高生长温度40 ℃;李王强等[19]筛选的马克思克鲁维酵母菌A2-13、库德毕赤酵母菌A2-1最高耐受温度42 ℃;本实验比他们所筛的耐高温酵母菌耐高温能力高;与石娇娇等[20]从自然发酵的甜面酱中筛选得到6株耐45 ℃高温的生香酵母相比,耐高温能力相当。

图5 温度对酵母菌ZG-3生长的影响Fig.5 Effect of temperature on ZG-3 growth of yeast

2.4 耐高温酵母菌的耐乙醇性研究

由图6可知,菌株ZG-3随着乙醇浓度的增加,OD值不断降低,当乙醇浓度高于6%时菌体生长明显受到抑制,乙醇浓度12%时仍有菌体生长,而乙醇浓度达15%时,菌株ZG-3不再生长,因此,菌株ZG-3耐乙醇浓度可达12%;高于姚晓瑞宁[21]等筛选的菌株D4、13耐乙醇浓度的9%,以及刘超帝等[7]筛选的马克斯克鲁维酵母KMBM2-5的6%;与谭才邓等[18]筛选的库德毕赤酵母菌A2-1耐乙醇浓度12%能力相当。由此可见ZG-3是一株很有应用开发潜力的耐高温耐乙醇的酵母菌。

图6 初始乙醇浓度对酵母菌的影响Fig.6 Effect of initial ethanol concentration on yeast

2.5 酵母菌的发酵力测定

在40 ℃下用含糖10%的发酵培养基培养菌株ZG-3,每隔2 h测定二氧化碳失重量,至CO2失重量不再减少,记录发酵时间为72 h,测得CO2失重量为7.40 g,酒精度为4.7%vol。

2.6 单因素实验结果

2.6.1 温度对酵母菌发酵性的影响 由图7可知,菌株ZG-3在发酵培养基中28～40 ℃下CO2失重量不断增加,在40～43 ℃下CO2失重量不断减少,表明菌株ZG-3的最适发酵温度为40 ℃。

图7 温度对酵母菌发酵性的影响Fig.7 Effect of temperature on yeast fermentability

2.6.2 pH对酵母菌发酵性的影响 由图8可知,当发酵pH为5.0时,CO2失重量达到最高为7.59 g。表明pH=5.0是菌株ZG-3在发酵培养基中最适发酵pH。酵母细胞的生长和胞内酶促反应都需要在一定的pH环境中进行,pH过高或过低都会影响酵母细胞膜所带电荷状态,使酵母生长代谢受阻[22]。

图8 初始pH对菌株ZG-3的发酵力影响Fig.8 Effect of initial pH on the fermenting power of strain ZG-3

2.6.3 葡萄糖浓度对酵母菌发酵性的影响 初始碳源的浓度对发酵也会产生影响,在工业化生产中,糖浓度一般不超过20%[22]。由图9可知,当初始葡萄糖浓度为140 g/L时,CO2失重量达到最高为8.11 g。表明在发酵培养基中140 g/L是菌株ZG-3的最适葡萄糖浓度。

图9 葡萄糖浓度对菌株ZG-3的发酵力影响Fig.9 Effect of glucose concentration on thefermentation capacity of strain ZG-3

2.6.4 接种量对酵母菌发酵性的影响 向pH为5、初始糖浓度140 g/L的发酵培养基接入不同量的菌液后在40 ℃培养菌株ZG-3,待发酵结束后测定CO2失重量,结果如图10所示。当接种量为12%时,CO2失重量达到最高为8.17 g。表明菌株ZG-3的最适接种量是12%。

图10 接种量对酵母菌发酵性的影响Fig.10 Effect of inoculation amount on yeast fermentability

2.7 重要因素筛选

根据表2～表5的方差分析结果可知,接种量的P值相对于发酵温度、初始pH和葡萄糖浓度大,所以响应面优化实验中选取发酵温度、初始pH、葡萄糖浓度三个具有显著影响的因素作为自变量。

表2 温度对酵母发酵性的影响方差分析Table 2 Analysis of the effect of temperature on yeast fermentability

表3 pH对酵母菌发酵性的影响方差分析Table 3 Analysis of the effect of pH on the fermentability of yeast

表4 葡萄糖浓度对酵母菌发酵性的影响方差分析Table 4 Analysis of the effect of glucose concentration on yeast fermentability

表5 接种量对酵母菌发酵性的影响方差分析Table 5 Analysis of the effect of inoculum size on yeast fermentability

2.8 响应面优化实验

2.8.1 Box-Behnken设计与结果 根据Box-Behnken试验设计原理,设计了17个试验的响应面分析试验,以菌株的发酵结束后CO2失重量作为响应值,选取发酵温度、初始pH、葡萄糖浓度三个具有显著影响的因素作为自变量,试验设计与结果见表6。

表6 Box-Behnken试验设计与结果Table 6 Box-Behnken test design and results

采用Design Expert 8.0.6软件对表6数据进行多元二次回归拟合,得到CO2失重量对A:发酵温度(℃)、B:初始pH、C:葡萄糖浓度(g/L)的多元回归方程为:Y=8.96+5.0×10-3A-0.097B+0.28C-0.13AB-0.043AC+0.072BC-1.46A2-1.00B2-0.90C2。回归方程决定系数R2=94.36%,表明94.36%的CO2失重量变化量可由此模型解释,且实际值与预测值之间的拟合度和可信度良好。

回归方程的方差分析结果见表7,整个模型极显著,回归模型F值为13.00,显著性检验为极显著(P=0.0014<0.01),失拟项不显著(P=0.0646>0.05),说明该模型余实际情况拟合良好。发酵温度、pH、葡萄糖浓度三个因素及其之间的交互作用都不显著,A2、B2、C2影响极显著(P<0.01)。该方程为ZG-3菌株发酵产酒精提供了一个合适的模型,因此可用上述模型代替实际实验对ZG-3菌株酒精发酵情况进行分析和预测。

表7 响应面回归方程的方差分析Table 7 Analysis of variance of response surface regression equation

2.8.2 各因素交互作用的响应面图 利用Design-Expert 8.0.6软件对二次响应面回归模型做出相应的响应曲面,结果如图11所示。

2.8.3 验证试验 由回归模型绘制的响应面图所示,回归模型存在最大点,为A=40.004,B=4.978,C=143.091,在此条件下理论预测CO2失重量为8.988 g,根据实际情况将参数修改为:A=40,B=5,C=140。即得最佳发酵条件为:发酵温度40 ℃,pH为5,葡萄糖浓度140 g/L,实验的实际值8.48 g,与预测值基本接近,说明所建模型拟合良好且可靠。采用蒸馏-酒精计法测得优化后的ZG-3的酒精产量为5.2%vol。

3 结论

经富集、纯化、耐高温筛选等操作从大曲中分离得到一株耐高温酵母菌,编号为ZG-3,经分子生物学鉴定,确定菌株ZG-3为库德里阿兹威毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)。其最高生长温度为45 ℃,耐乙醇能力可达12%。菌株ZG-3在40 ℃下发酵72 h,酒精产量为4.7%vol;通过响应面法优化,当接种量12%、发酵温度40 ℃、发酵pH为5和初始葡萄糖浓度140 g/L时,菌株ZG-3的酒精产量可以达到5.2%vol,由此可见ZG-3是一株很有应用开发潜力的耐高温耐乙醇的酵母菌。