小鼠PKM1基因慢病毒过表达载体的构建和稳定转染C2C12细胞株的筛选及其对糖酵解的影响

姜声旺,沈清武

(1.湖南农业大学动物科学技术学院,湖南长沙 410128; 2.湖南农业大学食品科学技术学院,湖南长沙 410128)

动物屠宰后,肌肉细胞以糖酵解的方式供能。糖酵解产生的乳酸和热量导致pH下降,躯体温度升高。高温和低pH使蛋白质变性,肌肉收缩,水分从细胞渗出,从而产生PSE(Pale,Soft,Exudative)肉,降低肉品质[1-3]。PSE的高发生率给屠宰业造成巨大的经济损失[4-6]。由此可见,减缓宰后糖酵解速度可有效控制PSE肉的发生,提高肉品质。丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)是糖酵解的限速酶之一,催化糖酵解的最后一步反应,将磷酸烯醇式丙酮酸的磷酸基团转移给二磷酸腺苷,生成丙酮酸和三磷酸腺苷[7-8]。有研究表明,PSE肌肉中的丙酮酸激酶可能发生了磷酸化或者乙酰化修饰,从而使得该肌肉中的丙酮酸激酶活性比正常肉中的要高,但具体机制尚不清楚[9-12]。

哺乳动物体内有4种PK同工酶:PKL、PKR、PKM1和PKM2,PKL和PKR是由PKLR基因编码的不同剪接体;PKM1和PKM2是由PKM基因编码的不同剪接体[13-15]。这四种剪接体的表达具有组织特异性,其中PKL主要在肝脏和肾脏中表达;PKR主要在红细胞中表达;PKM1主要在正常成年期尤其是肌肉组织中表达;而PKM2主要在胚胎发育期和肿瘤组织中表达[13-15]。小鼠PKM1和PKM2的差异在于PKM1含有外显子9而不含外显子10;PKM2含有外显子10而不含外显子9,二者之间共有22个氨基酸的差异[13-15]。慢病毒载体是在HIV-1病毒基础上改造而成的,能把外源基因有效地整合到宿主染色体中并持久表达目的基因,具有转导效率高、外源基因表达量高、表达稳定等优点[16-18]。“Golden Gate”克隆法是在同一反应体系中,利用ⅡS型限制性核酸内切酶,在识别位点后面切开DNA,产生带有粘性末端的DNA片段,同时用连接酶将几个DNA片段按照特定的顺序连接成无内切酶识别位点的DNA片段,具有省时省力且不含酶切位点片段的优点[19-20]。C2C12细胞是由Yaffe等[21]建立的小鼠成肌细胞株的亚克隆,在低血清条件下C2C12细胞被诱导分化成肌管,并表达myosin和myogenin等特征性蛋白。因此,C2C12细胞是研究成肌细胞增殖和分化的首选模型[22-25]。

本研究用“Golden Gate”克隆法构建了小鼠PKM1基因慢病毒过表达载体,筛选稳定转染PKM1基因的C2C12细胞株,为深入研究PKM1翻译后修饰对其自身酶活及细胞糖酵解的影响提供了材料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人胚胎肾上皮细胞293T、小鼠成肌细胞C2C12赛齐(上海)生物工程有限公司;pGEM-T载体系统(含JM109感受态细胞) 普洛麦格(北京)生物技术有限公司;pDown-3×FLAG-BsaI-ccdB-Cm-BsaI骨架载体、pLV.Des2d.C/EGFP:T2A:Puro骨架载体、病毒包装质粒Mix(pMDLG/pRRE、pCMV-VSVG、pRSV-Rev) 赛业(广州)生物科技有限公司;Stbl3感受态细胞 广州复能基因有限公司;动物组织总RNA提取试剂盒、TIANScript II cDNA第一链合成试剂盒、溴化乙锭(EB)溶液、6×DNA上样缓冲液、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒、无内毒素质粒大提试剂盒 天根生化科技(北京)有限公司;1.1×Super PCR Mix、DL2000 DNA Marker 北京擎科生物技术有限公司;Q5高保真DNA聚合酶2×预混液、BsaI-HFv2(含10×CutSmart Buffer)、ATP NEB(北京)有限公司;平末端DNA加A试剂盒 北京博凌科为生物科技有限公司;Gateway LR Clonase II Enzyme Mix(含蛋白酶K)、转染试剂Lipofectamine 2000 Reagent、HBSS 赛默飞世尔科技(中国)有限公司;DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS)、马血清(HS)、1×PBS、胰蛋白酶(0.25% Trypsin & 0.02% EDTA) Biological Industries公司;聚凝胺、嘌呤霉素 上海翊圣生物科技有限公司;SYBR Premix ExTaq II、Primescript RT reagent Kit with gDNA Eraser 宝生物工程(大连)有限公司;乳酸含量检测试剂盒 北京索莱宝生物科技有限公司;葡萄糖测定试剂盒(葡萄糖氧化酶法) 上海荣盛生物药业有限公司。

SW-CJ-2FD型洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;IX53型倒置显微镜 OLYMPUS公司;HF240型CO2培养箱、NeoFuge 1600R型离心机 力康生物医疗科技控股有限公司;DYCP-32B型琼脂糖水平电泳槽、DYCZ-24DN型垂直电泳槽、DYY-2C型电泳仪电源 北京六一仪器厂;ES-60型恒温孵育摇床 杭州米欧仪器有限公司;Veriti 96-well Thermal Cycler PCR仪 Life Technologies公司;Image Quant LAS 4000 mini型发光图像分析仪 美国通用电气公司;GBox F3型凝胶成像系统 Syngene 公司;Rotor-Gene Q型2通道荧光定量PCR仪 QIAGEN公司;FE20型pH计 梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司;1510型全波长酶标仪 Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 实验方法

1.2.1 Golden Gate法构建表达载体

1.2.1.1 总RNA提取 取小鼠背最长肌,用动物组织总RNA提取试剂盒提取总RNA。经琼脂糖凝胶电泳和A260/A280比值检测RNA完整性和纯度。

1.2.1.2 反转录合成cDNA第一链 以总RNA为模板,用TIANScript II cDNA第一链合成试剂盒反转录合成cDNA第一链。

1.2.1.3 引物设计 根据NCBI上公布的小鼠PKM1的cDNA序列(NM_001253883.1)设计引物。正向引物:5′ATGCCGAAGCCACACAGTGAAGC3′,反向引物:5′TCAAGGTACAGGCACTACACGCATG3′。含起始密码子和终止密码子。

1.2.1.4 目的片段的扩增回收 以cDNA 第一链为模板,加入上述引物(1.2.1.3)以及Q5高保真DNA聚合酶2×预混液,PCR扩增目的基因(PCR反应体系和反应条件按Q5高保真DNA聚合酶2×预混液说明书操作)。扩增出的序列为小鼠PKM1的完整双链cDNA,全长1596 bp。PCR产物用含EB染料的1%琼脂糖凝胶电泳,在紫外灯下根据DNA Marker确定目的片段位置并切胶用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段。

1.2.1.5 目的片段与T载体连接 用高保真酶扩增出的DNA片段是平末端,无法直接与T载体连接。因此,先用平末端DNA加A试剂盒在目的片段3′末端加上一个A碱基,然后再与线性化pGEM-T载体连接,连接产物转化JM109感受态细胞(连接和转化步骤按T载体说明书进行)并加入SOC培养基,37 ℃振荡培养1.5 h后,吸取部分菌液涂布到含氨苄青霉素的LB平板中,37 ℃培养过夜后挑取阳性单克隆菌落进行PCR鉴定。对鉴定正确的菌落进行摇菌培养。用质粒小提试剂盒提取质粒pGEM-T-mPKM1,并测序鉴定目的片段序列是否正确。

1.2.1.6 加酶切位点 以测序正确的质粒pGEM-T-mPKM1为模板,设计带有BsaI酶切位点及其保护碱基的引物,进行PCR。正向引物:5′ atcgGGTCTCG CAAGATGCCGAAGCCACACAGTGAAGC3′,反向引物:5′atcgGGTCTCGGGGTTCAAGGTACAGGCACTACA CGCATG3′。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后回收目的片段。

1.2.1.7 入门载体的构建 以骨架载体pDown-3×FLAG-BsaI-ccdB-Cm-BsaI和PCR产物(1.2.1.6)进行Golden Gate反应,构建入门载体pDown-3×FLAG/mPKM1。反应体系:0.75 μL BsaI-HFv2,1 μL 10×CutSmart Buffer,1 μL 10 mmol/L ATP,0.25 μL T7 DNA 连接酶,1 μL 20 ng/μL PCR产物,1 μL 100 ng/μL骨架载体,灭菌双蒸水补足至10 μL。反应程序:37 ℃ 5 min,20 ℃ 5 min,共15个循环,然后80 ℃灭活20 min。反应产物转化Stbl3感受态细胞,涂布到含卡那霉素的LB平板中,培养过夜后挑取单克隆菌落进行菌落PCR鉴定。鉴定正确的克隆菌落摇菌培养后用质粒小提试剂盒提取质粒,并送质粒测序鉴定目的基因序列是否正确,测序引物4条(表1)。

表1 测序引物名称及序列Table 1 Name and sequence of primer used for sequencing

1.2.1.8 表达载体构建 将测序正确的质粒(1.2.1.7)进行Gateway反应。13 ng启动子入门克隆 pUp-EF1A,13 ng入门载体pDown-3×FLAG/mPKM1,60 ng pLV.Des2d.C/EGFP:T2A:Puro骨架载体,1 μL Gateway LR Clonase II Enzyme Mix,TE buffer 补足至5 μL。25 ℃反应3 h后加入蛋白酶K终止反应10 min。反应产物转化Stbl3感受态细胞,涂布在含有氨苄青霉素的LB平板上培养。挑取单克隆菌落进行PCR,筛选阳性克隆,扩大培养后用无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒,酶切鉴定载体。鉴定正确的载体即为最终的表达载体pLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro-EF1A>3xFLAG/mPKM1。

1.2.2 慢病毒包装

1.2.2.1 293T细胞培养 转染前1 d,接种293T细胞到10 cm培养皿中,以转染当天的细胞达到90%汇合度为宜,转染前1 h时更换10 mL新鲜的完全培养基(90% DMEM+10% FBS)。

1.2.2.2 转染293T细胞 取1.5 mL灭菌EP管加入500 μL无血清DMEM,2 μg包装质粒Mix和2 μg表达载体质粒,混匀后静置5 min。另取一个1.5 mL灭菌EP管加入500 μL无血清DMEM以及8 μL转染试剂充分混匀后静置5 min。将两个EP管中的混合物合在一起混匀,静置20 min后逐滴加到细胞培养皿中,共转染293T细胞,轻轻混匀后置于细胞培养箱中孵育。转染5 h后,更换10 mL完全培养液,继续培养。

1.2.2.3 慢病毒收集浓缩 分别在48、72 h时,收集富含慢病毒颗粒的培养基到15 mL离心管中,500×g离心5 min去除细胞沉淀,回收上清,用0.45 μm的滤器过滤,收集滤液,50000×g高速离心2 h,弃上清。用适量HBSS充分溶解病毒沉淀,即为浓缩慢病毒。

1.2.2.4 qPCR法测定慢病毒滴度 制作qPCR标准品:将细胞内已知拷贝数的ALB基因克隆到载体并提取质粒,作为标准品1。标准品2为慢病毒表达质粒(含WPRE基因)。转导前1 d,接种293T细胞到6孔板中,转导前,消化一个孔的细胞进行计数,获取靶细胞数(A);病毒稀释一定倍数(B),转导293T细胞(V,mL),加入聚凝胺促进感染。48 h后,收集细胞并提取基因组DNA。

qPCR:用两条标准曲线分别获取DNA样品的ALB拷贝数和WPRE拷贝数,计算出平均每个样品中病毒序列的拷贝数C,进而根据以下公式计算出慢病毒滴度。

病毒滴度(TU/mL)=A×B×C/V

1.2.3 转染条件的优化

1.2.3.1 最佳MOI值的确定 将C2C12细胞用胰蛋白酶消化成单细胞,细胞计数后按3×105cells/孔 接种至6孔板内,加入2 mL完全培养基后置于5% CO2培养箱中37 ℃恒温培养24 h。将慢病毒配成感染复数(Multiplicity of infection,MOI)为10、20、30、40、50的稀释液并加入各孔中,继续培养。72 h后,根据EGFP的表达情况确定最佳MOI值。

1.2.3.2 最佳抗生素筛选浓度的确定 按1.2.3.1方法接种并培养细胞。24 h后,加入嘌呤霉素进行筛选。设0、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0 μg/mL共6个浓度梯度,每个梯度设2个复孔。观察并记录细胞生长状况,每2 d换一次新的含抗生素的培养基,继续筛选。抗生素最佳筛选剂量为3～4 d内导致全部细胞死亡的最低浓度。

1.2.4 稳转细胞株的筛选

1.2.4.1 细胞准备 按1.2.3.1方法接种细胞,加入2 mL完全培养基,置于培养箱中培养24 h。

1.2.4.2 病毒转导 细胞汇合度在30%～50%时,更换1 mL新鲜完全培养基,用胰酶消化其中一孔细胞并进行计数。将慢病毒在4 ℃下融解,轻轻混匀。根据细胞计数结果、病毒滴度和MOI计算病毒加入的量,每孔加入终浓度为5 μg/mL的聚凝胺提高转导效率,充分摇匀后放入培养箱培养。6 h后观察细胞状态(若见细胞有明显毒性反应,可将转导时间缩短为6～8 h),并更换2 mL新鲜的完全培养基。48 h后拍照,荧光显微镜下观察转染效果。

1.2.4.3 细胞纯化 按照病毒的筛选基因puro,对转导后的细胞更换为含最佳浓度嘌呤霉素的完全培养基进行药筛。每2 d更换新鲜的药筛培养基,继续传代扩增。细胞数量达到理想要求后,进行冻存及RT-qPCR和WB检测。

1.2.5 RT-qPCR检测目的基因mRNA表达量

1.2.5.1 细胞总RNA提取 提取总RNA并进行去DNA处理。

1.2.5.2 总RNA反转录 用 Takara Primescript RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行总RNA的反转录。

1.2.5.3 荧光定量PCR 以β-actin为内参,用 SYBR Green I染料法对目的基因表达情况进行相对定量,每个样品做三个平行,相对定量采用 2-ΔΔCT法。qPCR反应体系、反应程序按表2、表3进行(步骤2 60 ℃复性延伸时收集荧光信号),引物信息见表4。

表2 qPCR反应体系Table 2 qPCR reaction system

表3 qPCR反应程序Table 3 Reaction procedure of qPCR

表4 引物信息Table 4 Primer information

表2 qPCR反应体系Table 2 qPCR reaction system

1.2.6 Western Blot检测目的蛋白的表达量

1.2.6.1 诱导细胞分化 将生长状态良好、处于对数生长期的三种C2C12细胞(野生型、空载体、过表达)用胰蛋白酶消化后按3×105cells/孔接种到6孔板中。用含10% FBS的高糖DMEM培养基培养。细胞密度达到95%后,改用含2%HS的高糖DMEM培养基诱导成肌分化,每24 h更换一次培养基,第5 d时肌管形成率最高,收集细胞提取蛋白,同时收集培养基测定pH和乳酸含量。

1.2.6.2 蛋白提取 用PBS漂洗细胞后加入适量RIPA细胞裂解液,将细胞碎片和裂解液转移至离心管中(所有操作在冰上进行,所有试剂均预冷)。冰浴超声波破碎,功率200 W,超声20 s,间隔10 s,共25次。4 ℃ 12000×g离心10 min后收集上清液备用。

1.2.6.3 SDS-PAGE电泳 根据PKM1分子量大小(60 kDa)配制8%的分离胶,混匀后加到制胶玻璃板间,用异丙醇压平液面。凝固后倒掉异丙醇并用双蒸水清洗,用滤纸吸干水分。配制5%浓缩胶,加到分离胶上,插入梳子,凝固后将胶板装入电泳槽。倒入电泳缓冲液,淹没中间室。吸取适量蛋白样品,与等量2×SDS-PAGE loading buffer混匀,100 ℃金属浴加热5 min,取8 μL加于点样孔中,取1孔加入4 μL蛋白marker以确定目的条带。75 V电压电泳,待指示剂跑到底部时停止。

1.2.6.4 转膜 电泳结束后,切除多余的胶,剪取PVDF膜并用甲醇浸泡活化10 s,将凝胶、PVDF膜和滤纸在转膜缓冲液中平衡10 min,按照白板-海绵-3层滤纸-PVDF膜-凝胶-3层滤纸-海绵-黑板的顺序放置,250 mA恒流冰浴转膜1 h后取出PVDF膜。

1.2.6.5 封闭 PVDF用TBST洗涤液漂洗膜3次,5 min/次,洗去膜上的转膜液。加入封闭液,室温振荡孵育1 h。

1.2.6.6 抗体孵育及显色成像 封闭结束后漂洗膜3次。分别用兔抗鼠PKM1一抗和鼠抗FLAG一抗4 ℃孵育过夜,漂洗膜3次,再分别用羊抗兔二抗和马抗鼠二抗与对应的膜室温摇动孵育膜1 h。漂洗3次后用ECL化学发光法曝光成像并用Image J对蛋白进行定量。

1.2.7 细胞培养基的pH和乳酸含量测定

1.2.7.1 pH测定 用pH计直接测定各组培养基的pH。

1.2.7.2 乳酸含量测定 用乳酸含量测定试剂盒按照说明书进行测定。

1.2.8 C2C12细胞的葡萄糖消耗试验 将生长状态良好、处于对数生长期的三种C2C12细胞(野生型、空载体、过表达)用胰蛋白酶消化,然后用含10% FBS+1%双抗的高糖DMEM培养基将细胞浓度调整为2×105cells/mL,接种到12孔板中,每孔2 mL(即4×105cells/孔),培养24 h至细胞贴壁。用PBS洗涤后,更换为无血清的高糖DMEM培养基饥饿细胞12 h,使其同步化。再次吸弃培养基,用PBS洗涤后,更换为2 mL含血清的高糖DMEM培养基,同时设空白组(只加含血清的高糖DMEM培养基,不加细胞)。24 h后吸取各孔培养基,用葡萄糖测定试剂盒检测培养基中剩余葡萄糖含量,并按以下方法计算:

葡萄糖含量(mmol/L)=样本管吸光度/校准管吸光度×校准液浓度(5.55 mmol/L)

葡萄糖消耗量则按下式计算:

ΔGC=GC0-GCx

式中：ΔGC:各组细胞葡萄糖消耗量,mmol/L;GC0:未接种细胞的空白组中24 h后的葡萄糖含量,mmol/L;GCx:各组细胞培养24 h后培养基中剩余的葡萄糖含量,mmol/L。

1.3 数据处理

用Image J 1.52a计算条带灰度值从而对蛋白进行定量。pH、乳酸含量以及葡萄糖消耗试验各设3个生物学重复,每个重复测量三次。用SPASS 18.0软件进行统计分析和显著性检验,并用Prism 8.0.2绘图,实验数据以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 总RNA完整性和纯度检测

提取的总RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定出5S、18S和28S三条带(图1),A260/A280比值为2.05,说明提取的RNA完整性较好,纯度较高,可以用于反转录合成cDNA第一链。

图1 小鼠背最长肌总RNA电泳结果Fig.1 Total RNA s of mouse longissimus dorsi 注:1、2:提取的总RNA。

2.2 目的片段扩增

以反转录合成的cDNA第一链为模板,经PCR扩增获得小鼠PKM1编码区序列,产物经琼脂糖凝胶电泳出现了与预期大小(1596 bp)相符的条带(图2)。经测序,目的条带与NCBI公布的小鼠PKM1基因cDNA序列相似性为100%。

图2 小鼠PKM1基因cDNA电泳结果Fig.2 Electrophoresis results of cDNA of mouse PKM1 gene注:Marker:DL2000 DNA分子量标准;1:目的片段。

2.3 表达载体的酶切鉴定

用NheⅠ和ApaLⅠ酶切组合对表达载体(图3)进行酶切鉴定,预测会产生1246、2521、3287、3985 bp四个片段。实际酶切结果与预测结果一致,说明表达载体构建正确。测序结果表明,目的基因序列与NCBI数据库公布序列相似性为100%。

图3 表达载体图谱及其酶切鉴定结果Fig.3 Expression vector map and its enzyme digestion results注:Marker:GeneRuler 1 kb DNA分子量标准;1:NheⅠ和ApaLⅠ酶切产生的片段。

2.4 慢病毒滴度测定

经qPCR测定,浓缩后的慢病毒滴度为3.4×108TU/mL,该滴度可满足后续转染实验。

2.5 转染条件的优化

用荧光显微镜放大100倍观察不同MOI和不同抗生素浓度下的细胞形态,确定最佳MOI为30,最佳嘌呤霉素筛选浓度为1.2 μg/mL。如图4所示,A、B和C、D分别为最佳MOI和最佳药筛浓度下感染48 h后过表达组和对照组C2C12细胞的白光图和荧光图。由图4A、图4C可以看出细胞贴壁生长且呈梭状,符合该细胞的形态特征,说明慢病毒对细胞形态无明显损伤。从图4B、图4D可以看出,感染上慢病毒表达载体的细胞由于表达绿色荧光蛋白而呈现绿色,EGFP荧光率达80%以上,说明,感染成功,感染效率良好。

图4 最佳转染条件下的细胞状态Fig.4 Cell state under the optimal transfection conditions

2.6 qPCR检测目的基因mRNA表达量

用相对定量的方法检测目的基因的表达变化,按照2-ΔΔCT法对数据进行分析处理。结果表明,过表达组FLAG-mPKM1的表达量大约是对照组的9.4万倍(表5)。

表5 目的基因相对表达量Table 5 Relative expression level of target gene

2.7 Western Blot检测目的蛋白的表达量

用PKM1抗体进行Western Blot检测时,过表达组检测到两条目的条带,分别是内源性PKM1条带和带有Flag标签的外源PKM1条带,由于外源性条带含有3×FLAG标签,因此,蛋白分子量略微大于内源性的,而转空载体的细胞和野生型细胞只有一条内源性的PKM1条带。用FLAG标签抗体进行Western Blot检测时,过表达组由于含有FLAG标签,因此有一条带,而空载体组和野生型组由于不含FLAG标签因此没有条带(图5A)。综合以上结果表明,成功筛选到了过表达小鼠PKM1基因的C2C12细胞株且目的蛋白成功在细胞内表达,且经灰度值分析,内源性PKM1的表达量在三组之间无显著性差异。

图5 目的蛋白的Western Blot检测(A)及内源性PKM1相对表达量(B)分析Fig.5 Western Blot results of target protein(A)and relative level(B)of endogenous PKM1注:1:过表达组;2:空载体组;3:野生型组。n=3,字母不同代表显著性差异(P<0.05);图6～图8同。

2.8 细胞培养基的pH和乳酸含量以及葡萄糖消耗量测定

细胞糖酵解产生乳酸并释放到培养基中,乳酸积累导致培养基pH下降。因此,测定培养基的pH、乳酸含量以及葡萄糖的消耗量可以反映细胞的糖酵解情况。结果表明,空载体组与野生型组相比,培养基的pH、乳酸含量、葡萄糖消耗量均无显著性差异。但是与野生型组和空载体组相比,过表达组培养基的pH显著降低,乳酸含量以及葡萄糖消耗量显著增加(图6～图8)。说明过表达组细胞的糖酵解加剧,从图5B可知,三组之间内源性PKM1的量一致,由此推断过表达组糖酵解加剧是由外源过表达的FLAG-mPKM1造成的。

图6 培养基pHFig.6 pH values of culture fluid

图7 培养基乳酸含量Fig.7 Lactic acid content in culture fluid

图8 各组细胞的葡萄糖消耗量Fig.8 Glucose consumption of cells in each group

3 结论

本研究用“Golden Gate”法构建了小鼠PKM1基因慢病毒过表达载体并转染C2C12细胞,摸索出了慢病毒感染靶细胞的最佳条件:感染复数为30,嘌呤霉素浓度为1.2 μg/mL。成功筛选出了稳定过表达目的基因的细胞株。过表达组中FLAG-PKM1的mRNA表达量约是对照组的9.4万倍。FLAG-PKM1融合蛋白成功在宿主细胞内表达。通过测定培养基的pH、乳酸含量以及葡萄糖消耗初步证明PKM1促进了细胞的糖酵解。筛选出的稳转细胞株为进一步研究PKM1蛋白翻译后修饰对其自身酶活以及细胞糖酵解的影响奠定了材料基础。