甜樱桃葡萄座腔菌的生物学特性研究

张 倩,李 阳,杨 埔,张嘉慧,马志辉,张丽珍

(山西大学生命科学学院,山西省特色植物资源与研究利用重点实验室,山西太原 030006)

樱桃有较早的成熟期,素来有“春果第一枝”的美誉,食用价值高、经济效益好[1-3]。但在樱桃树生长过程中经常会遭到一些病虫害的影响,其中樱桃流胶病就是樱桃种植中常见的病害之一。樱桃流胶病会危害枝干,造成主干、主枝甚至枝条流胶,导致树势衰弱,树体抵抗力降低,果实产量和品质下降,严重时大枝枯死,甚至整株死亡[4]。意大利[5]、智利[6]等地均有发生。随着樱桃栽培面积的扩大,流胶病的发生也不断呈上升趋势,探明樱桃流胶病的病因以及寻求流胶病的防治方法对促进樱桃产业的发展具有十分重要的意义。

目前国内外对樱桃流胶病的研究多侧重于研究流胶的规律和其他相似核果类的致病菌。Bush[7]、Copes[8]、罗春香[9]和Saniewski[10]等多侧重于研究流胶的爆发期及外部因素的影响。吴文能等[11]、Koh等[12]、Tang等[13]和吴小芹等[14]等发现Botryosphaeriadothidea是猕猴桃采后果实腐烂病、苹果轮纹病及一些经济林、用材林、绿化林木和较为珍稀树种溃疡的主要致病菌。但并未对造成甜樱桃流胶的主要致病菌及侵染机理进行详细的研究。Griffin等[15]是最早研究樱桃流胶病的,但并未分离到引起樱桃流胶的关键致病菌。张福兴等[16]证实了甜樱桃溃疡型流胶病的致病菌属为Botryosphaeria,但仅对此致病菌属的致病性进行了简单描述,并未对其生物学特性进行系统化研究。因此,本实验在已成功分离纯化并通过回接验证一株能引起甜樱桃流胶的病原菌SXYTLJ01的基础上,对该菌株的生物学特性进行了更深入的探索。

本实验以在山西榆次樱桃园中甜樱桃流胶病枝上分离得到的病原菌SXYTLJ01为对象,通过观察其菌丝结构,不同胁迫条件下能否诱导产孢,其最适生长条件和致死温度等方面,对该菌株的生物学特性进行了研究,以期为该菌种建档提供有用信息,为明确病害的发病机理及防治提供试验基础与理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

病原菌SXYTLJ01菌株 从山西榆次樱桃园的流胶枝条上分离纯化得到;菌株保存在4 ℃的冰箱中,备用,在试验前转接马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基配方[17]:马铃薯20%,葡萄糖2%,硫酸镁0.2%,无水磷酸二氢钾0.2%,蛋白胨0.3%,琼脂2%),28 ℃暗培养,活化得到试验用菌落。琼脂 北京索莱宝科技有限公司;葡萄糖、可溶性淀粉、麦芽糖、乳糖、蔗糖 天津市风船化学试剂科技有限公司;蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵、硝酸钠、硝酸钾 北京奥博星生物技术有限责任公司;硫酸镁 天津市北辰方正试剂厂;无水磷酸二氢钾 北京精求化工厂;乳酸石炭酚棉兰染色液 北京索莱宝科技有限公司;Ezup柱式SK8259真菌基因组DNA抽提试剂盒、Taq Plus DNA聚合酶、10X PCR Buffer(含Mg2+)、dNTP(10 mmol/L)、灭菌去离子水、6×DNA Loading Dye、DNA Ladder Mix(100～10000 bp)、DNA Ladder Mix(100～3000 bp)、50×TAE、琼脂糖H、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒、异丙醇、1×TE 生工生物工程(上海)股份有限公司;无水乙醇 天津欧博凯化工有限公司。

BCM-1000A超净工作台 苏净安泰;霉菌培养箱、光照培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;OLYMPUSDP73正置荧光显微镜 东京都涉谷区幡之谷生产;ZD-88全温气浴振荡器 常州国宇仪器制造有限公司;PHS-3C PH计 上海仪电科学仪器股份有限公司;Verity 96well PCR仪、3730XL测序仪 美国ABI;FR-980A凝胶成像仪 上海复日科技有限公司;HC-2518R 冷冻离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;TD5A-WS 台式高速离心机 湖南湘仪实验仪器开发有限公司;DYY-6C电泳仪 北京六一仪器厂;DYCP-32B电泳槽 北京六一仪器厂;WH-3 微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器厂有限公司;HS-800D数显恒温水浴锅 太仓市科教器材厂;F619703-05 BP 系列精密单道可调移液器 加拿大BBI;SMA4000 UV-Vis Spectrophotometer Merinton;BCD-256KT冰箱 青岛海尔股份有限公司;7.8×6×10牛津杯 上海三麝实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 甜樱桃流胶病原菌的鉴定 用无菌解剖刀刮取0.1～0.2 g已在PDA培养基28 ℃暗培养活化的病原真菌SXYTLJ01的菌丝于1.5 mL离心管中,按SK8259(真菌)试剂盒操作提取基因组DNA,置于-20 ℃冰箱保存备用。应用真菌核糖体基因转录间隔区通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和EF-1α-NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)、EF-1α-NS6(5′-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3′)[18],以分离得到的病原菌基因组DNA为模板进行PCR扩增;引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。25 μL PCR反应体系:94 ℃预变性4 min,94 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,共30个循环,72 ℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳,在全能成像系统上观察并记录结果。PCR产物送往生工生物工程(上海)有限公司测序。靶基因序列进行BLAST比对,MEGA6.0程序处理,NJ邻接法[19]构建系统进化树,分析病原菌的亲缘关系,以确定其分类学地位。

1.2.2 菌丝结构的观察 利用光学显微镜进行菌丝结构观察:在回接有病原真菌SXYTLJ01的PDA上进行45°插片、28 ℃暗培养,培养3～7 d后用乳酸石炭酚棉蓝进行染色,镜检,观察该菌的菌丝形态结构[20]。

1.2.3 诱导产孢及孢子形态的观察 采用碳氮源缺乏、菌落划伤、近紫外线照射的方式诱导产孢[21]。每组处理至少重复3次。

碳氮源缺乏:将活化后长势良好的菌株分别接种于不加碳源(葡萄糖)的马铃薯琼脂培养基和不加氮源(蛋白胨)的马铃薯葡萄糖琼脂培养基,28 ℃暗培养3～7 d,用乳酸石炭酚棉兰染色,镜检,观察产孢情况。

菌落划伤:将活化后长势良好的菌株接种于PDA培养基,28 ℃暗培养2～3 d,用无菌刀片沿培养基中部将菌落划至见皿底,再培养1～3 d,在伤口边缘取样,染色液染色,镜检,观察产孢情况。

近紫外线照射:将活化后长势良好的菌株接种于PDA培养基,12 h近紫外线(18 W,直径19 mm波长253.7 nm,距离培养基50 cm)照射后28 ℃暗培养2～3 d,镜检,观察产孢情况。

1.2.4 最适生长条件 利用平板测定法[22]研究葡萄座腔菌的最适生长条件:将活化后长势良好的菌株接种于PDA培养基中央,采用十字交叉法每天定时测定菌落直径。分别将温度、光照、pH、碳源、氮源这些因素作为单因素试验条件,探究不同条件下菌株的生长状况。每个处理至少重复3次,取其平均值。

温度的影响:将菌株接种于PDA培养基中央,以15、20、25、28、30、35、40 ℃七个温度作为试验温度梯度,暗培养,每24 h测量一次菌落直径。

光照的影响:将菌株接种于PDA培养基中央,分别进行全光照、全黑暗、12 h光照/12 h黑暗交替三种培养处理,28 ℃培养,每24 h测量一次菌落直径。

pH的影响:将菌株分别接种于pH为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的PDA培养基中央,28 ℃暗培养,每24 h测量一次菌落直径。

碳源的影响:将菌株接种于不含碳源和碳源分别为蔗糖、麦芽糖、淀粉、乳糖、葡萄糖的PDA培养基中央,28 ℃暗培养,每24 h测量一次菌落直径。

氮源的影响:将菌株接种于不含氮源和氮源分别为牛肉膏、蛋白胨、硫酸铵、硝酸钾、硝酸钠的PDA培养基中央,28 ℃暗培养,每24 h测量一次菌落直径。

1.2.5 致病菌致死温度区间的确定 将活化后长满平板的菌落通过牛津杯取成直径约0.8 cm的菌饼,接取菌饼于5 mL PDB(马铃薯-葡萄糖肉汤培养基)培养基中,分别将试管放在35、40、45、50、55、60 ℃的恒温水浴锅中水浴20 min,对照组不水浴[23]。水浴完成后将上述试管置于28 ℃摇速为180 r/min振荡箱中暗培养72 h,观察菌丝生长情况。

将上述震荡培养的菌液进行平板回接验证。具体步骤:长出菌丝球的,分别用镊子钳取大小相同的菌丝块于PDA培养基;菌饼未生长的,分别用镊子从菌饼上钳取同等大小的菌块于PDA培养基。28 ℃暗培养,连续观察3～7 d,看是否生长。如果菌株在PDB培养液中经某一温度区间水浴后振荡培养不生长,且回接PDA培养基也不生长,则将此温度区间确定为菌株SXYTLJ01的致死温度区间。

1.3 数据处理

每组处理重复三次,取平均值;用Origin 8.0制图;用SPSS 22.0统计软件对差异显著性进行分析,P<0.05为显著水平,P<0.01为极显著水平;用MEGA6.0软件以NJ邻接法构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 基因序列分析

将ITS和EF-1α引物进行PCR扩增,菌株SXYTLJ01获得了长度为500 bp左右的清晰条带,电泳结果见图1。将纯化的PCR产物测序,分别获得了511 bp和444 bp的序列。

图1 PCR扩增产物凝胶电泳结果Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR amplified products

将测序所得的基因序列提交到NCBI的GenBank,应用BLAST进行同源序列比对。病原真菌的ITS序列和EF-1α序列与GenBank中Botryosphaeriadothidea分别有99.61%和99.77%的同源性。从GenBank数据库中选取代表葡萄座腔菌属不同种的ITS序列来构建系统发育树,结果显示:菌株SXYTLJ01与亲缘关系较近的葡萄座腔菌(BotryosphaeriadothideaMK448265.1)聚于同一支(图2)。结合形态学特征,最终将病原真菌SXYTLJ01鉴定为葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)。其ITS和EF-1α测序结果GenBank号分别为Accession No.SUB5881133H-ITS5_A01. ab1MN104148和Accession No.BankIt2240954 H-EF_A01.ab1BotryosphaeriaMN138458。

图2 SXYTLJ01菌株基于rDNA-ITS序列的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree based on the rDNA-ITS sequences of SXYTLJ01 pathogen

2.2 菌丝结构

菌丝经乳酸石炭酚棉兰染色后的菌丝结构如图3所示。

图3 葡萄座腔菌菌丝结构图Fig.3 Structure of hyphae of Botryosphaeria dothoidea注:图3a为40倍光学显微镜下观察所得；图3b为100倍下光学显微镜下观察所得。

40倍光学显微镜下,可以看到菌丝有明显节状结构,内含横膈膜,同时菌丝有树状分支,有些菌丝联结成网状。100倍光学显微镜下,可以看出菌丝内部分隔明显,将菌丝分隔成多个细胞,且菌丝呈分枝状态。

2.3 不同胁迫条件下诱导产孢情况分析

由图4可知:葡萄座腔菌孢子呈卵形或椭圆形,近紫外线照射、菌落划伤、营养缺乏均能诱导其产孢。近紫外照射下诱导产孢,如图4a,孢子在菌丝顶端分叉处大量聚集,大小不一。菌落划伤诱导产孢,如图4b,孢子呈卵形或椭圆形,有聚集现象。碳氮源缺乏诱导产孢,如图4c和4d,孢子聚集度小,便于单独观察及抑制实验的进行。

图4 不同胁迫条件下诱导产孢Fig.4 Induction of sporulation under different stress conditions注:a为紫外诱导产孢图;b为菌落划伤诱导产孢图;c为碳源缺乏诱导产孢图;d为氮源缺乏诱导产孢图。

2.4 致病菌最适生长条件

2.4.1 致病菌生长与温度的关系 培养3 d后,菌落直径与温度的关系如图5所示。

图5 不同培养温度对菌落生长的影响Fig.5 Effect of different culture temperatures on colony growth注:图中不同字母代表菌落直径差异的显著性(P<0.05),图6～图9同。

由图5可以看出,温度是影响该致病菌生长的重要因素,在15～35 ℃下该菌均能生长,但菌落直径存在显著性差异;15～28 ℃之间,菌落直径随着温度的升高显著增加,致病菌的最佳生长温度为28 ℃;28～35 ℃之间,菌丝直径会随着温度的升高而持续下降;高于40 ℃时,致病菌不再生长。综上,该致病菌的最适生长温度为28 ℃。

2.4.2 致病菌生长与光照的关系 培养3 d后,菌落直径与光照类型之间的关系如图6所示。

图6 不同光照类型对菌落生长的影响Fig.6 Effect of different light types on colony growth

由图6可知,无论何种光照类型,菌丝均能生长,但在不同光照条件下菌落直径存在差异,全光照与全黑暗的菌落直径差异不显著,与交替光照的菌落直径存在显著性差异。由实验结果可以看出,在培养到第3 d时,12 h光照/12 h黑暗交替培养比全光照、全黑暗的菌落直径大。综上,光照类型对该菌生长影响明显,该致病菌的最适生长光照条件为12 h光照/12 h黑暗交替光照。

2.4.3 致病菌生长与pH的关系 培养3 d后,菌落直径与pH的关系如图7所示。

图7 不同pH对菌落生长的影响Fig.7 Effect of different pH values on colony growth

由图7可以看出,pH在5.0～10.0范围内该菌均能生长,但在不同pH下菌落直径存在差异,pH在5.0～7.0范围内菌落直径差异不显著,在8.0～10.0范围内菌落直径存在显著性差异;菌丝生长更适合偏酸性环境,pH为6.0时菌落直径最大,说明在pH6.0下菌丝生长速率相对最快;当pH高于6.0时,菌丝还会生长,且随着pH的升高,菌落直径差异显著,但都低于同培养天数下pH6.0时的菌落直径。综上,pH对该致病菌生长影响明显,偏酸性的环境更有利于该菌的生长,以pH6.0最佳。

2.4.4 致病菌生长与碳源的关系 培养3 d后,菌落直径与不同碳源的关系如图8所示。

图8 不同碳源对菌落生长的影响Fig.8 Effect of different carbon sources on colony growth

由图8可以看出,在不加碳源以及以蔗糖、麦芽糖、淀粉、乳糖、葡萄糖为碳源时,该菌均能生长,但是各实验组菌落直径存在显著差异。不加碳源的培养基菌落直径增长最慢;以淀粉为碳源时,菌落直径与不加碳源组差异不显著、与其他组有显著性差异;以蔗糖和麦芽糖为碳源时,两组菌落直径差异不显著,菌落直径相对较大,但与葡糖糖和乳糖为碳源时的菌落直径有显著差异,且比这两组的菌落直径要小;以葡萄糖和乳糖为碳源时,两组菌落直径差异不显著,但葡萄糖的菌落直径明显要比乳糖大。综上,碳源对该致病菌生长有重要影响,在以葡萄糖为碳源时该菌长势最好,而以蔗糖、乳糖、麦芽糖这些双糖作为碳源时生长稍差,以淀粉为碳源时生长最差。

2.4.5 菌丝生长与氮源的关系 相同的培养时间,菌落直径与不同氮源的关系如图9所示。

图9 不同氮源对菌落生长的影响Fig.9 Effect of different nitrogen sources on colony growth

由图9可以看出,不加氮源实验组以及以牛肉膏、蛋白胨、硫酸铵、硝酸钠、硝酸钾为氮源的实验组菌落均能生长,但是不加氮源组的菌落直径明显落后于加氮源组的,说明氮源为该菌生长的重要条件。从图中可以看出,蛋白胨组、硫酸铵组、硝酸钾组和硝酸钠的菌丝直径差异不显著,但硫酸铵的菌落直径>蛋白胨菌落菌落直径,而以硫酸铵为氮源的菌落直径明显低于以硝酸钠、硝酸钾为氮源的实验组。综上,氮源为该致病菌生长的重要影响因素,且以硝酸钠、硝酸钾为氮源时,该菌生长最快,因此硝酸钠、硝酸钾类硝酸盐类为该致病菌生长的最佳氮源。

2.5 致病菌致死温度区间的确定

分别经35、40、45、50、55、60 ℃水浴20 min并振荡培养72 h后,菌丝生长情况如图10,回接后菌丝生长情况如图11。

图10 不同温度对菌落生长的影响Fig.10 Effect of different temperature on colony growth

图11 PDA回接实验结果Fig.11 PDA verification experiment results

由图10可知,分别经35、40、45、50、55、60 ℃水浴20 min后,28 ℃对照组、35、40、45、50 ℃实验组均有菌丝生长且均形成了菌丝球,55、60 ℃的PDB培养液清澈,无菌丝生长。

取各试管中的培养液进行PDA回接实验,结果如图11。经28、35、40、45、50 ℃水浴20 min后回接在PDA培养基上,PDA培养基均有菌落生长,而经55、60 ℃水浴20 min后回接在PDA培养基上,PDA培养基无菌落生长。由以上实验可知:该致病菌的致死温度区间为50～55 ℃。

3 讨论与结论

本实验以山西榆次樱桃园流胶树体上分离纯化得到的一株葡萄座腔菌为试验菌株,对其生物学特性进行了试验研究。预实验阶段将葡萄座腔菌分别接种于查氏培养基和PDA培养基,结果发现PDA培养基更适合此菌生长;试验阶段通过对菌丝结构的观察,发现该致病菌菌丝有明显节状结构,内含横膈膜,同时菌丝有树状分支,有些菌丝联结成网状。通过菌落划伤、近紫外线照射及营养缺乏进行诱导产孢试验发现,三种胁迫方式均能诱导其产生孢子,这一观察与何靖柳等[21]在观察红阳猕猴桃葡萄座腔菌时的结果相反,却与韩青梅等[24]在研究Botryosphaeriadothidea侵染苹果果实的研究结果一致。

该葡萄座腔菌的孢子为卵形或椭圆形,大小不一,有聚集现象,与Phillips等[25]对葡萄座腔菌孢子形态的描述一致。

研究最适生长条件的实验结果表明,温度、光照、pH、碳源、氮源均为葡萄座腔菌生长的重要影响条件。葡萄座腔菌最适温度为28 ℃,有力说明了5～9月份为发病较为严重阶段的原因[16]。葡萄座腔菌最适光照条件为12 h光照/12 h黑暗交替。卢伟[26]对桂花叶斑病病原葡萄座腔菌(B.dothidea)进行生物学特性的研究试验也认为病原菌生长的最适光照条件为交替光照,但罗光明等[27]认为光照对病原菌的生长无明显影响。葡萄座腔菌最适生长pH为6.0,说明致病菌适生存于偏酸性环境。最适碳源为葡萄糖,最适氮源为硝酸钠、硝酸钾类硝酸盐。该致病菌水浴处理20 min的致死温度区间为50～55 ℃,这与黄静等[28]对侵染草莓的落叶松葡萄座腔菌的致死温度70 ℃(20 min)不一致;这说明不同植株上分离的致病菌虽然同属葡萄座腔菌,但生物学特性有所差异。这些结果表明即使是同类植物,分离得到的致病菌特性也不相同,因此对葡萄座腔菌应该专株专治。

我国多样的气候及各种地理环境造就了丰富的葡萄座腔菌科真菌。本实验所用的葡萄座腔菌来自山西榆次樱桃园流胶树体,葡萄座腔菌是引起多种树体流胶的病原菌之一,通过本实验对该致病菌生物学特性的研究结论,可以为其防治工作提供一定的理论基础:调节樱桃树的栽种温度,栽种土壤中性偏碱,避免硝酸类肥料,在樱桃树生长过程中要保护树体,避免让树体出现伤口,减少紫外线照射,尽可能破坏致病菌生长的最佳条件,抑制葡萄座腔菌的生长,从而降低甜樱桃流胶病的发病率,增加甜樱桃产量。