低温交联时间对酸诱导罗非鱼碎肉鱼糜凝胶特性的影响

高 宇,毕保良,孔令富,李红金,王晓雯,贾 丹

(云南农业大学动物科学技术学院,云南昆明 650201)

2018年云南省罗非鱼(Oreochromisniloticus)的养殖总产量达到15.48万吨,超过四大家鱼,位居云南省第一,占云南省淡水鱼养殖总量的26%[1]。云南省罗非鱼主要以初级加工产品罗非鱼片和冷冻罗非鱼出口为主,深加工产品很少[2]。在鱼片生产过程中会产生约占鱼重10%的碎肉,目前大部分碎肉被制备成鱼粉饲料,经济附加值较低。张萍[3]利用碎肉来制备生化试剂蛋白胨,也有学者采用酶水解法来制备蛋白质水解液[4]或者活性肽[5]。因此如何合理高效地利用罗非鱼碎肉,是目前罗非鱼加工副产物利用亟待解决的主要问题之一。

鱼糜制品是近几年我国发展最为迅速的水产深加工产品之一,已有研究将罗非鱼碎肉加工成热诱导或酸诱导鱼糜凝胶制品。目前热诱导凝胶制品技术已经相当成熟且关于热诱导凝胶及其凝胶形成机制的报道较多[6-7]。关于酸诱导凝胶的研究主要集中在葡萄糖酸内酯(glucono-δ-lactone,GDL)在低温条件下诱导鱼糜凝胶网络结构的形成上。GDL在高水分体系中分解为葡萄糖酸和内酯,葡萄糖酸能使体系pH降至蛋白质等电点,使颗粒间的排斥力转变为吸引力,在低温条件下长时间交联导致蛋白质聚集形成凝胶[8-9]。Riebroy等[10]研究发现大西洋鳕鱼(Gardusmorhua)的肌动球蛋白添加GDL后,室温放置48 h可以形成蛋白凝胶。郑严等[11]研究发现当GDL添加量为2.1%、酸化温度为35 ℃、酸化时间2.0 h可以制备高凝胶强度、冷藏即食的真鲷(Pagrusmajor)鱼糜凝胶制品。鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)肌动球蛋白在4 ℃长时间的酸诱导条件下可以形成凝胶网络结构,且其凝胶强度随GDL含量的增加而提高[12]。但目前鲜有关于GDL对罗非鱼碎肉凝胶特性影响方面的研究报道。实验前期研究发现,获得品质较高的低温罗非鱼碎肉蛋白凝胶,最适GDL添加量为2.4%,但交联时间对酸诱导罗非鱼碎肉凝胶特性的影响还有待研究。

因此,本研究以罗非鱼碎肉为原料,研究酸诱导蛋白在低温交联过程中的化学作用力及凝胶特性的内在联系,旨在揭示酸诱导罗非鱼碎肉在低温交联过程中的凝胶形成机制,以期为高品质的低温凝胶化产品在生产工业中的应用提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗非鱼(Oreochromisniloticus)碎肉 云南新海丰水产科技集团有限公司;葡萄糖酸内酯(GDL) 北京索莱宝科技有限公司;2,4,6-三硝基苯磺酸、二硫代硝基苯甲酸 Sigma公司。

TA-XTPlus物性分析仪 英国Stable Micro System公司;TU-1800紫外-可见光分光光度计 北京普析通用仪器公司;高速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 鱼糜凝胶的制备 将冷冻的罗非鱼碎肉在4 ℃冰箱解冻12 h,去掉杂质、黑膜、结缔组织,用5倍质量的自来水漂洗2次,再用5倍0.5% NaCl溶液漂洗1次,每次漂洗10 min,添加鱼糜质量2.5%的NaCl斩拌,再添加鱼糜质量2.4%的GDL和去离子水使鱼糜水分含量达到80%,混合均匀后挤入直径3.5 cm的聚偏二氯乙烯肠衣中,放置于4 ℃条件下,交联时间分别为0、5、10、15、20和24 h,到达交联时间后,去掉肠衣立即取样。

1.2.2 鱼糜凝胶自由氨基含量的测定 参考文献[13],并修改如下:2 g鱼糜凝胶溶解于18 mL硼酸缓冲液,均质,于75 ℃水浴15 min,60 ℃水浴2 h,4000×g离心5 min后取0.25 mL上清液,加2 mL磷酸缓冲液和2 mL 0.1%的2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid solution,TNBS),混匀,于50 ℃水浴60 min(锡箔避光),后用4 mL 0.1 mol/L HCl终止反应,室温冷却30 min 后,于340 nm测定其吸光值。标准曲线采用L-亮氨酸制作,标曲为y=0.1089x+0.0412,R2=0.9921。

1.2.3 鱼糜凝胶二硫键含量的测定 参考Dan等[14]的方法。取2 g鱼糜凝胶分散在20 mL的Tris-甘氨酸缓冲液中(pH8.0,含0.086 mol/L Tris,0.09 mol/L甘氨酸,0.004 mol/L乙二胺四乙酸(EDTA)和8 mol/L尿素),12250×g下离心10 min,取上清液待用,并同时用Lowry法测定蛋白浓度。

测定游离巯基SHF含量时,移取200 μL二硫代硝基苯甲酸[(5,5′-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)]Ellman’s添加到4 mL的蛋白上清液中,室温下反应1 h,于412 nm测定其吸光值。

测定总巯基SHT含量时,1 mL蛋白上清液中加入4 mL 20 mmol/L Tris-Gly缓冲液于40 ℃水浴1 h,然后用20%的三氯乙酸(TCA)沉淀蛋白1 h,4000×g离心10 min,收集沉淀用20%的TCA漂洗3次,沉淀用l0 mL的Tris-甘氨酸缓冲液溶解。取200 μL的Ellman’s试剂添加到4 mL的蛋白溶液中,于412 nm测定其吸光值。

SHT、SHF含量根据公式(1)计算分别得到,S-S含量根据公式(2)表示:

SH(μmol/g protein)=73.53A412/c

式(1)

S-S(μmol/g protein)=(SHT-SHF)/2

式(2)

式中:c:蛋白浓度,mg/mL;A412:412 nm处的吸光值;73.53:106/13600,13600 mol·cm/L为摩尔消光系数。

1.2.4 鱼糜凝胶化学作用力的测定 参考Ni等[15]的方法。取2 g鱼糜凝胶分别与10 mL的0.05 mol/L NaCl(SA)、0.6 mol/L NaCl(SB)、0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素(SC)和0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素(SD)混合并均质。于4 ℃静置1 h,然后于12096×g离心15 min。用Lowry法测上清液中蛋白质的含量。离子键的贡献以溶解于SB溶液中的蛋白质与溶解于SA溶液中的蛋白质的含量之差表示,氢键的贡献以溶解于SC溶液中的蛋白质与溶解于SB溶液中的蛋白质的含量之差表示,疏水相互作用力的贡献以溶解于SD溶液中的蛋白质与溶解于SC溶液中的蛋白质的含量之差表示。

1.2.5 鱼糜凝胶强度的测定 除去肠衣,将鱼糜凝胶切成直径为20 mm的圆柱体,平衡至室温,用质构仪进行穿刺实验。采用P/0.25S型号的探头对样品进行一次压缩,压缩距离为15 mm,测前速度为1 mm/s,测试速度为1 mm/s,测后速度为1 mm/s,测试过程中出现的第一个峰值为破断强度,峰值所对应的压缩距离为凹陷深度,破断强度与凹陷深度的乘积即表示凝胶强度[16]。

1.2.6 鱼糜凝胶Texture Profile Analysis(TPA)参数的测定 参考殷俊等[17]的方法并略作修改。除去肠衣,将鱼糜凝胶切成直径为10 mm的圆柱体,并置于质构仪探头正下方的样品台上,采用P/36R型号的探头,测前速度为1 mm/s;测中速度为1 mm/s;测后速度为1 mm/s;采用70%的压缩比例进行测试。选取弹性、硬度(kg)、粘聚性、咀嚼度(kg)和回弹性作为TPA参数,参数定义和计算方法参照Cardoso等[18]的报道。硬度表征鱼糜凝胶能承受的最大力;弹性和回弹性则表征鱼糜凝胶的弹性及形变后的恢复能力;粘聚性表征鱼糜凝胶的粘性;咀嚼度则表征鱼糜凝胶的咀嚼的难易程度,值小则咀嚼性差,值过大则难咀嚼,其值适中则适口性较好。

失水率(%)=(m1-m2)×100/m1

式(3)

1.3 数据处理

每组实验重复3次,数据以平均值±标准差(Mean±SD)表示,均采用GraphPad Prism.V5.0软件(GraphPad Software Inc.,La Jolla,USA)作图,采用SAS 8.0 软件(SAS Institute,Cary,North Carolina,USA)进行统计与分析。检测实验数据正态分布和方差齐性后,进行单因素方差分析(One-way ANOVA),然后用Duncan检验比较各样本数据之间的差异显著性,显著性水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 低温交联时间的酸诱导鱼糜凝胶自由氨基的影响

低温交联时间对酸诱导罗非鱼鱼糜凝胶自由氨基含量的影响如图1,在低温条件下,随着交联时间的延长,自由氨基含量显著降低(P<0.05),而交联时间在5～10 h时鱼糜凝胶的自由氨基含量之间没有显著性差异,当交联时间为15～24 h自由氨基含量显著下降(P<0.05)。说明在低温条件下的酸诱导凝胶形成过程中,5～10 h交联时间内生成的γ-羧酰胺基和伯胺发生交联键的数量显著高于0 h(P<0.05),而15～24 h交联时间内生成的γ-羧酰胺基和伯胺发生交联键的数量显著高于0～10 h(P<0.05)。这是因为赖氨酸是谷氨酰胺转胺酶(TGase)交联反应的底物之一,TGase可以催化γ-羧酰胺基和伯胺发生交联反应,导致自由氨基含量降低。因此赖氨酸含量(通过测定自由氨基而得)的变化通常用来表示TGase催化交联反应的程度,自由氨基含量越低,说明γ-羧酰胺基和伯胺发生交联键的数量越多[20]。

图1 低温交联时间对酸诱导罗非鱼鱼糜凝胶自由氨基的影响Fig.1 Effect of low temperature crosslinking timeon free amino group of tilapia surimi gel induced by acid注:不同大写字母标注表示不同时间处理存在显著差异(P<0.05);图2～图6同。

2.2 低温交联时间对酸诱导鱼糜凝胶游离巯基(SHF)、总巯基(SHT)、二硫键(S-S)含量的影响

低温交联时间对酸诱导罗非鱼鱼糜凝胶SHF、SHT和S-S的影响如图2。低温酸诱导过程中,随着交联时间的延长,SHF含量随着交联时间的延长而下降,20～24 h交联时间内的SHF含量显著低于0～15 h(P<0.05),而SHT在5～24 h交联过程中含量没有显著的变化(P>0.05),S-S含量随着交联时间的延长而增加,在20 h达到最高。前期研究发现,2.4% GDL作用鱼糜24 h后,因GDL水解成葡萄糖酸使得鱼糜pH下降到4.37(数据未呈现)。故在低温条件下,蛋白质酸变性导致更多的SHF被氧化成S-S。S-S是半胱氨酸和胱氨酸的巯基被氧化生成的分子内和分子间的化学键。在蛋白质分子中巯基是最具活性的功能基团,巯基存在于肌球蛋白分子内部,当肌球蛋白结构发生变化,暴露出SHF,这些SHF就会发生氧化反应形成S-S[21]。

图2 低温交联时间对酸诱导罗非鱼鱼糜凝胶游离巯基(SHF)、总巯基(SHT)、二硫键(S-S)的影响Fig.2 Effects of low temperature crosslinking timeon free sulfhydryl,total sulfhydryl,disulfide bond oftilapia surimi gel induced by acid

2.3 低温交联时间对酸诱导鱼糜凝胶化学作用力的影响

低温交联时间对酸诱导鱼糜凝胶化学作用力的影响如图3。由图3可知,随着交联时间的延长,罗非鱼碎肉凝胶的氢键含量显著降低。离子键含量呈先下降后上升趋势,但整体来看,在低温交联过程中,酸诱导凝胶体系中离子键所占比例最小,疏水相互作用所占的比例最大,且随着低温交联时间的延长,呈现先增后减的趋势,且疏水相互作用促进了酸诱导凝胶网络结构的形成。蛋白凝胶中,溶解于SA和SB溶液中的主要是肌动蛋白、原肌球蛋白、肌钙蛋白及一些低分子量的蛋白质[22],由此可知,在低温酸诱导凝胶形成过程中,这些蛋白通过比非特异性结合、离子键更强的化学作用力存在于蛋白凝胶中,故在低温交联过程中,非特异性结合和离子键含量随着交联时间的延长而降低(24 h对应的离子键含量除外),且氢键含量也随着交联时间的延长而显著下降(P<0.05)。这说明非特异性结合、离子键和氢键不是维持低温酸诱导凝胶体系的主要化学作用力。这可能是在凝胶形成过程中,离子键和氢键参与肌球蛋白分子尾部的缠绕,而不参与头部的聚集[23]。在酸处理过程中,离子键和氢键开始断裂,蛋白变性,疏水基团开始暴露,体系产生疏水相互作用,造成肌球蛋白分子聚集。同时二硫键和γ-羧酰胺基和伯胺发生交联键也开始形成,最终形成致密性较强的凝胶网络结构。

图3 低温交联时间对酸诱导罗非鱼鱼糜凝胶非化学作用力的影响Fig.3 Effect of low temperature crosslinking time on the non-covalent bonds of tilapia surimi gel induced by acid注:a:非特异性结合;b:离子键;c:氢键;d:疏水相互作用。

2.4 低温交联时间对酸诱导鱼糜凝胶特性的影响

2.4.1 低温交联时间对酸诱导鱼糜凝胶强度的影响 低温交联时间对酸诱导罗非鱼鱼糜凝胶强度的影响如图4。随着交联时间的延长,碎肉鱼糜凝胶的破断强度在24 h显著高于5～15 h(P<0.05),但15和20 h的凝胶的破断强度无显著性差异(P>0.05),这说明24 h鱼糜凝胶中蛋白质分子间的紧实程度显著高于5～15 h,而15和20 h凝胶的紧实程度无差异。凹陷深度在交联5～20 h无显著性差异,但24 h时凝胶的凹陷深度显著低于15～20 h(P<0.05),这表明交联24 h后鱼糜凝胶的弹性较15～20 h相比反而有所下降。鱼糜凝胶的凝胶强度在20 h显著高于交联5～15 h(P<0.05)。这是因为GDL水解形成葡萄糖酸,促进蛋白酸变性,且随着交联时间的延长,低温条件下酸诱导过程中γ羧酰胺基和伯胺发生交联键、二硫键和疏水相互作用使得蛋白之间聚集从而形成了高强度的凝胶。鱼糜凝胶的破断强度和凝胶强度均在20～24 h达到最高,但长时间的交联(24 h)会使得蛋白凝胶的凹陷深度下降。

图4 低温交联时间对酸诱导罗非鱼鱼糜凝胶强度的影响Fig.4 Effects of low temperature crosslinking timeon gel strength of tilapia surimi gel induced by acid

2.4.2 低温交联时间对酸诱导鱼糜凝胶TPA性能的影响 由图5可以看出,在低温过程中,随着交联时间延长,硬度、咀嚼度和回弹性都呈现先增后减的趋势,当交联时间为20 h时,鱼糜凝胶的硬度达到最高,说明20 h时鱼糜凝胶能承受的外力最强。而咀嚼度在15～20 h时达到最高。回弹性在10 h达到最高,说明10h时鱼糜凝胶形变后的恢复能力最强。随着交联时间的延长,回弹性呈下降趋势,但整体来看,10～20 h时鱼糜凝胶恢复形变的能力显著(P<0.05)高于5和24 h的。而弹性随着交联时间的延长呈现上升的趋势,但在10～24 h无显著性差异(P>0.05)。粘聚性随着交联时间的延长无显著性差异,而长时间的交联(24 h)反而使得粘聚性有所下降。综合鱼糜凝胶的破断强度、凹陷深度和凝胶强度指标,为了获得较好的鱼糜凝胶特性,最佳的低温交联时间为20 h。

图5 低温交联时间对酸诱导罗非鱼鱼糜凝胶质构的影响Fig.5 Effect of low temperature crosslinking time on gel texture of tilapia surimi gel induced by acid

2.5 低温交联时间对酸诱导鱼糜凝胶失水率的影响

鱼糜凝胶失水率与持水性成负相关,失水率越小,凝胶持水性能越好。蛋白凝胶的持水性与极性氨基酸结合水的能力、水分子分布、凝胶网络结构等因素有关[24-25]。由图6可知,当交联时间在0～10 h之间,鱼糜凝胶的失水率无显著性差异(P>0.05),随着交联时间的增加,失水率呈现显著上升趋势(P<0.05)。说明随着交联时间的延长,凝胶的持水性下降。整体来说,酸诱导凝胶持水性都低于热诱导鱼糜凝胶,通常加热鱼糜凝胶的持水性与凝胶强度存在正相关关系[26],但本研究发现酸诱导鱼糜凝胶的持水性和凝胶强度的变化并没有呈现正相关。在低温过程中,酸诱导凝胶形成过程中持水性的下降,可能是因为蛋白内部的疏水基团会逐渐暴露出来,疏水相互作用在酸凝胶中起主导作用,结果导致凝胶中的蛋白分子结合水分子的能力下降,从而降低了凝胶的持水性[27]。

图6 低温交联时间对酸诱导罗非鱼鱼糜凝胶失水率的影响Fig.6 Effect of low temperature crosslinking timeon the expressible moisture of tilapia surimi gel induced by acid

3 结论

本研究表明,罗非鱼碎肉在2.4% GDL诱导蛋白凝胶形成过程中,最佳的低温交联时间为20 h。在低温酸诱导过程中,γ-羧酰胺基和伯胺产生的交联键、二硫键和疏水相互作用使得碎肉蛋白之间发生交联从而形成了高强度的凝胶。蛋白凝胶的质构特性随着交联时间的延长而增加,但持水性随着交联时间的延长而下降。这一结果为后续开发高品质的低温凝胶化产品提供了重要依据。