复方中药提取液对家兔血液动力学效应影响的研究

2020-06-19王小玉纪康华郭云霞郝庆红王圣赞吴国江

饲料工业 2020年11期

■王小玉纪康华郭云霞郝庆红王圣赞吴国江

（河北农业大学生命科学学院，河北保定071000）

血液凝固性增加，血小板的聚集与黏附均会影响血流动力学效应。从古至今，在中医药针对心脑血管性疾病的实践总结中，我们发现这些研究中积累了许多改善血流状态的珍贵经验。有研究表明[5]，丹参能够通过下调凝血系统活性[6]和上调纤溶系统活性[7]维持凝血与纤溶系统的平衡。除此之外，还能够抑制血小板聚集与黏附[8]，改善血流速度[9]。多项研究表明[10]，三七能够降低血液黏度，改善内皮功能[11]，抑制血小板活化[12]，提高纤溶活性[13]，减少凝血因子含量[14]。而黄芪也有实验证明[15]，能够改善内皮素-1（ET-1）引发的血管收缩[16]，抑制血小板聚集[17]，保护血管内皮细胞[18]。

本研究以家兔为试验动物，将丹参、三七与黄芪按2∶1∶10 比例联用，通过考察AT-Ⅲ、PC、ET-1、t-PA、TXB2、和PF4 等指标，探讨复方中药提取液对改善血流动力学效应的作用效果，为养殖业中经常发生血管损伤的防治提供适宜药物及最佳剂量。

1 材料

1.1 试验动物

25只健康成年家兔2.0～2.5 kg，雌雄各半，河北保定家兔养殖场提供。家兔在实验室条件下，自由采食及饮水7 d。

1.2 试验药品及耗材

丹参、三七、黄芪，购自安国中药材市场；20%甘露醇，购自山东齐都药业有限公司；抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）测定试剂盒、抗凝蛋白C（PC）测定试剂盒、内皮素-1（ET-1）测定试剂盒、组织型纤溶酶原激活物（t-PA）测定试剂盒、血栓烷素（TXB2）测定试剂盒、血小板因子4（PF4）测定试剂盒，均购自钰博生物科技有限公司；生理盐水，购自华裕(无锡)制药有限公司；24G×0.75静脉留置针，购自苏州碧迪医疗器械有限公司。

1.3 试验仪器

RE-52A旋转蒸发仪，购自上海亚荣生化仪器厂；JA2103 电子天平，购自金坛市华特试验仪器有限公司；752型紫外-可见分光光度计，购自上海舜宇恒平科学仪器有限公司；LDZ-52普通离心机，购自北京离心机厂；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱，购自上海飞越试验仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 动物模型建立

将已在实验室条件下适应7 d 的25 只家兔依试验随机分为2组，对照组（共1组）和受试组（共4组）。其中，对照组（5 只）耳缘静脉注射复方生理盐水（3 ml/kg），3次/d，共3 d；受试组（5只/组，共20只）分别利用静脉留置针于耳缘静脉注射20%甘露醇（3 ml/kg），3 次/d，共3 d。给药3 d 后依据血液生化指标AT-Ⅲ活性和TXB2活性及肉眼观察静脉血管外形进行分析评价，确定造模成功。

2.2 试验药物准备

试验研究依照配方组分及比例（2∶1∶10）分别称取丹参、三七、黄芪，混合均匀用水浸泡3 h后，加至8 倍体积水，用药锅大火熬制至沸腾，再用小火煎熬30 min，经纱布过滤，重复上述煎药过程1次，最后将两次滤液合并，于旋转蒸发仪内浓缩，使药物浓缩至生药含量为1 g/ml，放入4 ℃冰箱中，备用。

药物使用时，使低、中、高剂量的药物浓度稀释至含生药量分别为0.2、0.4、0.8 g/ml。

孩子的个性不同，所处的年龄阶段不同，对父母的需求不同，良好亲子关系的格式也会有所不同。良好的亲子关系表现为依恋不依赖，理性不冷漠。父母需要很好地回应并引导孩子，使亲子之间和而不同，保持一种有弹性的融洽关系。

2.3 试验动物的分组及给药剂量

动物造模成功后，将受试组随机分为模型组（Ⅱ组）、药物低剂量组（Ⅲ组）、药物中剂量组（Ⅳ组）、药物高剂量组（Ⅴ组）及对照组（Ⅰ组），共5组。给药量：对照组（1 ml/kg，生理盐水）；模型组（1 ml/kg，生理盐水）；药物低剂量组（1 ml/kg，提取液0.2 g/ml）；药物中剂量组（1 ml/kg，提取液0.4 g/ml）；药物高剂量组（1 ml/kg，提取液0.8 g/ml）。灌胃给药7 d后，通过耳缘静脉取血进行下一步试验研究。

3 复方中药的使用对静脉血栓的作用效果研究

3.1 血清的制备

每组于造模后及给药7 d 时通过耳缘静脉取血，将采集到的血液于3 500 r/min 离心10 min，取上清液，4 ℃保存，备用。

3.2 复方中药的使用对家兔抗凝系统的检测

PC和AT-Ⅲ有很好的抗凝活性，会直接影响凝血与抗凝的平衡。因此，试验通过检测家兔血清中PC及AT-Ⅲ活性的多少来反映药物对家兔抗凝系统的影响。操作方法按照PC和AT-Ⅲ试剂盒的操作步骤进行。

3.3 复方中药的使用对家兔纤溶系统的检测

ET-1 是体内最强的缩血管物质，ET-1 增加，血管内皮细胞受损，t-PA含量下降，t-PA为纤溶系统中的关键物质，主要功能是溶解血管内血栓。因此，试验通过检测家兔血清中ET-1 及t-PA 活性的多少来反映药物对家兔纤溶系统的影响。操作方法按照ET-1和t-PA试剂盒的操作步骤进行。

3.4 复方中药的使用对家兔血小板系统的检测

TXB2使血小板发生凝集及血管收缩，可直观反映血管的淤血情况。PF4的含量变化反映了血小板的释放程度。因此，试验通过检测兔血清中TXB2及PF4活性的多少来反映药物对家兔血小板系统的影响。操作方法按照TXB2和PF4试剂盒的操作步骤进行。

3.5 数据统计

使用GraphPad Prism 6.0 进行数据分析，所有计量数据均用“平均值±标准差”表示，用P＜0.05表示差异显著且具有统计学意义。

4 结果与分析

4.1 动物模型建立结果分析

表1 兔血清中AT-Ⅲ、TXB2活性测定的结果

注：同列数据不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），相同小写字母表示差异不显著（P＞0.05）；下表同。

由表1 可见，与对照组相比，受试组的AT-Ⅲ活性明显降低（P＜0.05），TXB2 的活性明显升高（P＜0.05），说明试验造模成功。

图1 家兔耳缘静脉血管变化

由图1 可见，对照组家兔耳缘静脉管径粗细均匀，管壁薄而柔软，透过管壁可见腔内红色流动血液；而受试组家兔耳缘静脉管径明显扩张，质地坚硬，呈暗红色。除此之外，家兔眼球因血液凝固堵塞静脉管腔导致的血液回流障碍而明显突出，显示造模成功。

4.2 复方中药的使用对家兔抗凝系统的作用效果（见表2）

表2 家兔血清中AT-Ⅲ、PC活性测定的结果

由表2 可见，与Ⅰ组相比，Ⅱ组的AT-Ⅲ和PC 的活性明显降低（P＜0.05），说明试验造模成功；与Ⅱ组相比，各受试组AT-Ⅲ和PC 活性显著升高（P＜0.05），说明各药物均对AT-Ⅲ和PC活性的升高有较好的改善作用；Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组与Ⅰ组相比AT-Ⅲ和PC 活性差异均不显著（P＞0.05），但Ⅳ组、Ⅴ组的抗凝效果要明显优于Ⅲ组。

4.3 复方中药的使用对家兔纤溶系统的作用效果（见表3）

表3 家兔血清中ET-1、t-PA活性测定的结果

由表3可见，与Ⅰ组相比，Ⅱ组的ET-1活性明显升高，t-PA 的活性明显降低（P＜0.05），说明试验造模成功；与Ⅱ组相比，各受试组ET-1 活性明显下降，t-PA 的活性明显升高（P＜0.05），说明各药物均对ET-1和t-PA 的活性变化有较好的改善作用；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组与Ⅰ组相比ET-1 和t-PA 活性差异均不显著（P＞0.05），但Ⅳ组、Ⅴ组的溶栓效果要明显优于Ⅲ组。

4.4 复方中药的使用对家兔血小板系统的作用效果（见表4）

表4 家兔血清中TXB2、PF4活性测定的结果

由表4可见，与Ⅰ组相比，Ⅱ组的TXB2和PF4的活性明显升高（P＜0.05），说明试验造模成功；与Ⅱ组相比，各受试组TXB2 和PF4 的活性明显下降（P＜0.05），说明各药物均对TXB2 和PF4 的活性变化有较好的改善作用；Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组与Ⅰ组相比，TXB2和PF4活性的差异均不显著（P＞0.05），但Ⅳ组、Ⅴ组的抗血小板效果要明显优于Ⅲ组。

5 讨论

血管损伤在养殖业中是时常会发生的。由于动物患病，尤其是高热性疾病，本身就会导致血流速度变慢，而在治疗过程中的动物保定不确定、静脉注射技术不佳、留置针长时间滞留在血管中会进一步加重血管损伤，改变血流状态，加速血液凝固[19]。初期，动物主要表现为局部炎性水肿、体温升高、精神沉郁、食欲减退，若不及时疏通血管，严重时会导致动物死亡，给养殖业带来巨大的经济损失[19]。目前，对于血管损伤的治疗大多数为西药，虽然在短时间内达到了很好的治疗效果，但同时会产生很大的副作用，影响后续治疗[20-21]。中医认为，此病属于血瘀、肿胀等范畴，是血凝、肿胀和运行不畅的结果。根据现代药理学发现，我国传统中药丹参[6]、三七[10]具有抗血小板聚集、促进纤维蛋白溶解、抗凝血等作用；黄芪[22]具有促进血液流动、抗凝血，抑制血小板聚集等作用。本试验以丹参、三七和黄芪为方剂，三者联用相辅相成，最终达到协同改善血流动力学效应的目的。

溶液浓度的高低可直接影响血管内皮细胞的通透性，而本试验注射的20%甘露醇为高渗溶液，输注后内皮细胞的通透性会随着渗透压的升高而降低[23]。甘露醇以微粒的形式存在于溶液中，大量微粒在短时间内迅速进入静脉，可造成局部堵塞。其中部分较大的微粒还会在血管壁上沉积，加重血管壁损伤[24]。此外，由于家兔耳缘静脉比较薄，加上使用留置针时局部的包扎和制动，使静脉血流变慢，血小板得以沉积，进一步加重血管内皮损伤，从而加重血液凝固。试验结果表明，与对照组相比，受试组的AT-Ⅲ活性明显降低，TXB2的活性明显升高（P＜0.05），且肉眼可明显观察到受试组家兔耳缘静脉管径明显扩张，质地坚硬，呈暗红色，显示造模成功。因此，在饲料中添加能够促进抗凝血物质释放或抑制血小板聚集与黏附的药物可在一定程度上保护血管，改善血液动力学效应，防止血液凝固。

ET-1 存在于血管内皮细胞，是现阶段发现的作用力最强、作用时间最长的缩血管物质[25]。可通过对血管孔径及血流量的干预，诱导血管内皮细胞损伤[26]。当内皮细胞受损后合成并释放t-PA物质减少，从而抑制纤溶系统的活性，促进血液凝固[27]。试验结果显示，家兔灌胃中药复方提取液中、高剂量后ET-1活性明显降低，t-PA活性明显升高，与模型组比较差异显著（P＜0.05），与对照组相比差异不显著（P＞0.05），说明药物在降低ET-1活性，升高t-PA活性方面有很好的作用效果，并且在一定程度上能够保护血管内皮细胞免受损害。凝血和纤溶平衡失调是改变血流动力学效应的重要环节之一。AT-Ⅲ、PC是人体内重要的抗凝物质，在维持抗凝和凝血平衡方面有着重要作用。当发生异常时，AT-Ⅲ、PC的消耗量增加，体内AT-Ⅲ、PC含量下降，使机体凝血功能亢进，促进血液凝固[28]。试验证实，中、高剂量的复方中药提取液能够升高AT-Ⅲ和PC 活性，与模型组相比差异显著（P＜0.05），与对照组相比差异不显著（P＞0.05），说明药物在一定程度上能够升高AT-Ⅲ和PC活性，维持机体凝血与抗凝血的平衡。除此之外，通过血小板的聚集及黏附也会影响血流状态。PF4的含量变化反映了血小板的激活程度。PF4的升高会激活血小板同时使释放反应亢进[29]。活化后的血小板会释放血栓素（TXA2）使血小板发生凝集及血管收缩，由于TXA2 半衰期短，性质不稳定，易转化为稳定的TXB2，故多以TXB2 间接反映TXA2。试验结果表明，家兔在灌胃复方中药提取液中、高剂量后TXB2和PF4活性明显降低，与模型组相比差异显著（P＜0.05），与对照组相比差异不显著（P＞0.05），说明药物在降低TXB2和PF4活性方面有很好的作用，能够在一定程度上抑制血小板聚集。但在给予家兔高剂量药物时，出现了不同程度的少食、精神萎靡及死亡等现象。因此，丹参、三七和黄芪为方剂的中药提取液浓度在0.4 g/ml时为最佳治疗剂量。