防御素对肠道炎症反应和微生物的调节机制

■颜文新 刘 刚，2 方 俊*

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410128；2.中国科学院亚热带农业生态研究所，湖南长沙410125）

由于仔猪的肠道尚未发育健全，易受病原微生物、外来抗原和其他有毒有害分子的侵袭，导致肠道屏障功能受损，菌群失调，细菌与内毒素移位，产生炎性反应[1-2]。这种炎性反应又会进一步损伤肠黏膜，增加肠通透性，促使细菌移位，而形成恶性循环，导致全身炎症反应，使得猪处于亚健康状态，降低了动物对营养物质的利用率，还降低了生产效率[3]。

防御素是先天免疫的主要效应物，在宿主免疫系统中起着重要的作用，其重要性已被广泛认可[4-5]。潘氏细胞(Paneth cell)系的肠上皮细胞能产生并分泌的抗菌肽——α防御素，使得细胞可以感受以细菌、胆碱以及其他外界刺激，进而通过去除病原体并与有益微生物共生，保持肠道稳态平衡[6-7]。防御素对细菌有选择性的抑菌活性，可以有效地杀死致病细菌，但对某些共生细菌的抑菌活性很小，对某些共生细菌无抑菌活性[8-9]。多个研究显示防御素对肠道微生物群组成具有调节作用，肠道炎症状态下的肠道抗菌肽，特别是防御素在回肠和结肠中表达紊乱，从而影响了整个肠道的稳态[10-11]。因此，防御素可能作为连接微生物和疾病的一种机制起着关键作用，本文综述了防御素在仔猪肠道炎症反应中的作用，并对防御素调控仔猪肠道炎性反应的机制进行了讨论。

1 肠道中的微生物及菌群失衡

肠道吸收了生命所必需的营养成分，肠上皮细胞直接与食物和微生物接触，处于不断的刺激之下，因而他们在营养吸收和黏膜免疫等方面发挥着重要作用[12-13]。肠道中的微生物大约有1×1014个，正常肠道菌群由数量庞大的共生的微生物组成[14-15]。近年来，人们发现肠道微生物区系与各种疾病之间的相关关系。其重要原因之一是由于宏基因组分析技术的快速发展，这种分析技术对不可培养的微生物也能够有效的定量和检测[16]。同时，抗菌肽及防御素在调节微生物群作为先天免疫主要效应物的重要性也得到了广泛的认可[10-11，17]。潘氏细胞响应某些刺激从而表达α-防御素，α-防御素不仅直接参与除去病原体，而且有助于维持正常肠道菌群建立稳态[10，18]。

肠道微生物是免疫系统的关键调节剂。肠道微生物在不同的效应和记忆T 细胞群体的分化中起作用，这是产生IL-17 等促炎因子和IL-10 等抗炎因子所必需[19]。目前已有许多研究报道了肠道炎症中微生物菌群失调，例如共生细菌多样性减少和黏膜相关细菌数量增多与肠道炎症发展相关[20]。宏基因组学研究也显示了肠道炎症中微生物与对照组微生物区系的差异，目前认为：①肠道炎症中几种硬壁菌门和拟杆菌门的数量减少。在拟杆菌中，脆弱拟杆菌（B.fragilis）在诱导结肠炎的小鼠模型中显示出重要的保护作用[21]。此外，在厚壁菌类中，普氏粪杆菌（F.prausnitzii）数量减少[22]。在肠道炎症的小鼠模型中，口服普氏粪杆菌可以降低炎症反应，并有助于恢复正常的微生物组成[22]。因此，脆弱拟杆菌和普氏粪杆菌的丰度下降可能导致肠道的炎症状态；②肠道炎症中变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）水平增加，特别是黏附侵袭性大肠杆菌的数量较高[23-24]。研究已经证明侵袭性大肠杆菌可以入侵巨噬细胞，在细胞内复制，并刺激产生大量肿瘤坏死因子（TNF-α）等促炎因子；③肠道炎症中穿透黏液层的细菌数量增加[25-26]。在肠道炎症的肠上皮细胞中经常可以观察到一些黏液溶解细菌如活泼瘤胃球菌（Ruminococcusgnavus）和扭链瘤胃球菌（Ruminococcus torques）[27-28]。因此，肠道炎症期间微生物群可能与黏膜接触更密切[29]。

2 肠道屏障与潘氏细胞及分泌的防御素

肠道屏障在肠道免疫功能中发挥着重要的作用，允许离子、水和其他营养物质透过肠道屏障，但肠道内的微生物无法通过肠道黏膜屏障。肠道由一层柱状上皮细胞组成，为抵抗进入肠腔的微生物提供了第一道防线。这些细胞中超过80%的细胞是肠上皮细胞，而其余的则是肠分泌细胞、杯状细胞或潘氏细胞[30]。

潘氏细胞分泌的α-防御素是小肠上皮产生和释放的主要抗菌肽。潘氏细胞也分泌其他的抗菌肽如Reg3γ、溶菌酶和分泌型磷脂酶A2等[31]。此外，潘氏细胞是肠上皮微环境的重要组成成分，并与肠道干细胞发生相互作用[7]。潘氏细胞可以产生生长因子和Wnt 信号分子，导致Wnt 和Notch 关闭，这些物质被递送到隐窝基柱状细胞诱导特定上皮细胞谱系的分化。因此，潘氏细胞在肠道天然免疫和小肠上皮细胞的再生/分化中起重要作用[32-33]。然而，潘氏细胞最重要的作用是通过分泌α-防御素为肠道提供防御作用。

α-防御素不仅具有杀死病原体的功能，也可以通过维持正常肠道微生物群的组成而有助于肠道动态平衡。例如，基质金属蛋白酶-7（matrix metalloproteinase 7，MMP7）缺陷型小鼠的回肠微生物群，由于缺乏激活了的隐窝素，与野生型小鼠相比，厚壁菌门的比例明显升高，类杆菌比例显著下降[34]。此外，在潘氏细胞中表达α-防御素HD5 转基因的DEFA5+/+小鼠中，肠道中的微生物菌群组成与野生型菌株显著不同，厚壁菌门比例下降，同时拟杆菌门比例上升[35]。在潘氏细胞分泌的六个最丰富的α-防御素中，cryptdin4 是最有效的杀微生物剂。Masuda 等发现具有三个二硫键的cryptdin4 显示出对致病菌的有效杀菌活性，但对共生细菌例如双歧杆菌、干酪乳杆菌和脆弱拟杆菌没有抑菌活性或抑菌活性很低[10]。相反，没有二硫键的cryptdin4 则杀死致病细菌和共生细菌。这些结果表明，潘氏细胞分泌的α-防御素具有二硫键依赖性的杀菌活性，并在通过调节肠道微生物的组成来维持肠道环境中发挥作用。

3 炎症状态下潘氏细胞被破坏，打破肠道稳态

尽管我们对仔猪肠道炎症发病机制的认识还不全面，但目前的研究已经揭示出了许多炎症的风险因子及一些与病原相关分子模式，自噬和内质网应激反应的识别受体有关，这些分子还多都有在潘氏细胞中表达。此外，遗传缺陷NOD2、自噬和内质网应激基因影响潘氏细胞选择性，可能会影响肠道炎症的发病机制[36]。在具有自噬基因Atg16L1 缺陷的小鼠中，潘氏细胞出现形态学异常并且伴有分泌缺陷[37]。研究指出突变的Atg16L1 及诺如病毒特异性菌株的感染导致潘氏细胞的破坏[38]。此外，敲除Xbp1 基因导致蛋白无法正确折叠，诱导出小鼠潘氏细胞凋亡，进而导致严重的回肠炎[39]。此外，在缺失前梯度2 基因（Anterior Gradient 2）的结肠炎小鼠中发现了无法分泌粘蛋白2 的杯状细胞，同时由于内质网应激导致了潘氏细胞形态改变[40-41]。这些结果表明导致潘氏细胞稳态破坏的遗传缺陷可通过减少α-防御素的产生和分泌而削弱肠道的先天免疫。

4 结论

从潘氏细胞及其分泌的α-防御素的作用最近研究进展来看，防御素对于稳定肠道微生物群的组成非常重要。他们通过防止细菌过度生长和抵抗潜在的致病细菌侵入上皮从而促进了肠道的正常功能。防御素表达的改变对微生物群具有负面影响并且可以引起炎症状态。防御素在肠道炎症中表达的改变在肠道炎症的发病机制中可能起重要作用，特别是回肠炎症与潘氏细胞分泌的防御素的缺乏有关。恢复防御素的正常表达可重新平衡肠道微生物群并改善肠道炎症。综上所述，防御素可通过调控肠道微生物从而成为肠道炎症及抗炎治疗潜在的新靶点。但防御素介导的炎症反应的机制仍值得探索。