基于网络药理学的固本健脑液防治阿尔兹海默病的活性成分与作用机制研究

毛剑琴，袁德培*，张誉丹，覃 亚

1.湖北民族大学(湖北 恩施 445000) 2.湖北民族大学风湿病发生与干预湖北省重点实验室(湖北 恩施 445000)

阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种最常见的神经退行性疾病，占痴呆症的50%～75%，目前仍无法治愈。患者多出现记忆障碍，认知功能下降，行为障碍及生活能力障碍等临床表现。其病因尚不明确，病机假说有多种，涉及Aβ假说、tau蛋白异常磷酸化假说、神经元凋亡假说、自由基损伤假说、免疫异常假说、基因突变假说、胆碱能损伤假说、金属离子代谢紊乱、内分泌失调假说等理论[1]。相关流行病学研究显示[2]，全球AD患者已达4 680万，且呈上升趋势，因此，如何有效的防治AD意义重大。固本健脑液是基于老年性痴呆“脾肾亏虚、脑髓失养、兼有痰瘀”的中医病理假说，结合多年临床研究研制的医院制剂，具有培固后天之本，补脾益肾，健脑醒神，兼化痰瘀之功效，亦有研究证实，固本健脑液能有效改善AD患者的临床症状[3]。目前对此方治疗AD的作用靶点和机制尚未明确，仍需进一步研究。

网络药理学是基于系统生物学的理论，融合多向药理学和系统生物学思想，阐述靶标与疾病网络之间的协同效应和潜在机制。本研究以固本健脑液为对象，利用网络药理学，构建“成分-靶点-通路-机制-AD”网络，进一步阐述固本健脑液防治AD多成分、多靶点和多通路的特点，为拓宽固本健脑液临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1数据来源GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)；人类孟德尔遗传(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)数据库(http://www.omim.org/)；Pubmed数据库(http://pubmed.cn)；TCMSP数据库(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)；UltraEdit软件；Cytoscape3.7.1 软件；string数据库(https://string-db.org/)；Bioconductor数据库(http://http://bioconductor.org)；R软件；Perl软件。

1.2方法

1.2.1 固本健脑液化学成分数据库的构建 以固本健脑液中五味中药(党参、茯苓、酸枣仁、山楂、枸杞)为关键词，基于数据库样本数据复杂性与TCMSP用户指南，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，药物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18为筛选条件，检索TCMSP数据库获取固本健脑液各药物成分的化学信息和关键靶点信息。

1.2.2 AD靶蛋白的收集及前处理 GeneCards数据库keywords中输入“alzheimer’s disease”进行检索，所得信息输出为Excel；打开OMIM数据库，在Advanced Search一栏中选GeneMap，再检索alzheimer’s diseae，待搜索完毕，download为Excel格式。

1.2.3 固本健脑液-AD靶蛋白交集的整理 整理出固本健脑液的潜在靶蛋白与AD相关靶蛋白，分别形成drug.txt和disease.txt两个文件，在R软件中安装"VennDiagram"数据包，用UltraEdit软件编写整理出靶蛋白交集的脚本，在R中运行，输出靶蛋白交集，为drug.disease.txt，并构成Venn图。

1.2.4 固本健脑液“成分-靶点”网络与蛋白互作网络(protein protein interaction network,PPI network)的构建与评估 根据中药成分、靶点之间的关系，建立活性成分-靶点网络，采用Cytoscape 3.7.1进行网络可视化，并在R中用barplot函数绘制核心蛋白靶点的柱状图。根据1.2.3中得到的drug.disease.txt，检索string数据库，在Multiple proteins右边输入所有靶蛋白，在Organism下方选择Homo sapiens进行搜索，隐去孤立的蛋白靶点，以minimum required interaction score=0.4为评判标准，从而得到固本健脑液防治AD关键靶点之间的相互作用关系。

1.2.5 对关键靶蛋白进行GO和KEGG富集分析 根据1.2.3中得到的drug.disease.txt，在Bioconductor中找到"DOSE"、"clusterProfiler"、"pathview"3个安装包，在R中运行安装。之后用UltraEdit编辑运行GO和KEGG的脚本，在R中运行，得到GO分析的柱状图、散点图和数据结果，得到KEGG的柱状图、散点图、通路图和相关数据。

2 结果

2.1固本健脑液化学成分和靶蛋白通过TCMSP数据库检索到固本健脑液化合物217个。以OB≥30%，DL≥0.18为筛选条件，筛选得到固本健脑液活性化学成分76种，见表1。

表1 固本健脑液候选活性成分表

MOL001979LAN42.120.75MOL000449Stigmasterol43.830.76MOL000358beta-sitosterol36.910.75MOL005406atropine45.970.19MOL005438campesterol37.580.71MOL006209cyanin47.420.76MOL00744924-methylidenelophenol44.190.75MOL008173daucosterol_qt36.910.75MOL008400glycitein50.480.24MOL010234delta-Carotene31.800.55MOL000953CLR37.870.68MOL00960414b-pregnane34.780.34MOL00961524-Methylenecycloartan-3beta,21-diol37.320.80MOL00961724-ethylcholest-22-enol37.090.75MOL00961824-ethylcholesta-5,22-dienol43.830.76MOL00962024-methyl-31-norlanost-9(11)-enol38.000.75MOL00962124-methylenelanost-8-enol42.370.77MOL009622Fucosterol43.780.76MOL00963131-Norcyclolaudenol38.680.81MOL00963331-norlanost-9(11)-enol38.350.72MOL00963431-norlanosterol42.200.73MOL0096354,24-methyllophenol37.830.75MOL009639Lophenol38.130.20MOL0096404alpha,14alpha,24-trimethylcholesta-8,24-dienol38.910.76MOL0096414alpha,24-dimethylcholesta-7,24-di-enol42.650.75MOL0096424alpha-methyl-24-ethylcholesta-7,24-dienol42.300.78MOL0096446-Fluoroindole-7-Dehydrocholesterol43.670.72MOL0096467-O-Methylluteolin-6-C-beta-glucoside_qt40.770.30MOL009650Atropine42.160.19MOL009651Cryptoxanthinmonoepoxide46.950.56MOL009653Cycloeucalenol39.730.79MOL009656(E,E)-1-ethyloctadeca-3,13-dien-oate42.000.19MOL009662LantadeneA38.680.57MOL009664PhysalinA91.790.27MOL009665Physcion-8-O-beta-D-gentiobioside42.900.62MOL009677lanost-8-en-3beta-ol34.230.74MOL009678lanost-8-enol34.230.74MOL009681Obtusifoliol42.550.76MOL000098quercetin46.430.28

2.2固本健脑液-PBC靶点交集检索固本健脑液相关靶点共2 920种，排除重复靶点和与76种有效成分无关靶点后，得到695种。经GeneCards数据库检索，与AD相关靶点共有7 600个；经OMIM检索，与AD相关靶点有95个。两个数据库靶点汇合，排除重复靶点，共得到7 690个靶点。通过在线Venn图得到药物和疾病共同的靶点459个，即固本健脑液防治AD的关键靶点，见图1。

图1 固本健脑液-AD靶点交集Venn图

2.3固本健脑液“成分-靶蛋白-通路”网络与蛋白互作网络(PPI)的建立

2.3.1 化合物-靶蛋白网络分析 运用Cytoscape3.7.1将中药、中药主要化学成分、关键靶蛋白与疾病关系可视化，如图2所示，红色为疾病(AD)，绿色为中药名(固本健脑液)，黄色为中药主要化学成分，蓝色为关键靶点。

图2 中药-化学成分-关键靶点网络图

2.3.2 PPI网络 查询String数据库，将459个关键靶点蛋白进行PPI网络可视化，如图3所示。其中TP53、AKT1、JUN、TNF、HSP90AA1等靶点与较多的其他靶点相关联，为核心靶点，见图4。

图3 固本健脑液防治AD靶点相互作用网络图

图4 barplot函数核心蛋白图

2.4GO分析与KEGG分析

2.4.1 GO分析结果 GO主要是进行靶蛋白功能分析。通过运算，与关键靶蛋白相关功能共有302种。根据相关性分析，固本健脑液防治AD主要是通过影响机体的受体配体活性、辅因子结合、G蛋白偶联受体结合、核受体活性、转录因子活性直接配体调节的序列特异性DNA结合等而发挥作用。如图5，6所示，柱状图颜色越红，说明相关性越高；点状图点越大，说明相关性越高。

图5 GO分析结果柱状图

图6 GO分析结果点状图

2.4.2 KEGG分析结果 通过关键蛋白在Bioconductor数据库中，找到与之相关通路187条，根据通路中所含关键靶蛋白数目和相关性评分，排名前20条通路为固本健脑液防治AD的关键通路，如图7和图8所示，柱状图颜色越红，说明相关性越高；点状图点越大，说明相关性越高。固本健脑液防治AD涉及前列腺癌信号通路、糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路、人巨细胞病毒感染信号通路、钙信号通路、癌症中的蛋白聚糖信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、IL-17信号通路、乙型肝炎信号通路、恰加斯病信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性信号通路、非酒精性脂肪肝信号通路、内分泌阻力信号通路、细胞衰老信号通路、丙型肝炎信号通路、胰腺癌细胞信号通路、膀胱癌信号通路、HIF-1信号通路、结肠直肠癌信号通路。其中人巨细胞病毒感染、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染为重要通路。图9所示为Human cytomegalovirus infection信号通路，标红的为此通路中固本健脑液防治AD的重要靶蛋白，涉及TNF、PTGS2、GSK3B、RELA、EGFR、AKT1、CASP9、IL6、CASP3、NFKBIA、MDM2、BAX、CASP8、TP53、CASP8、CASP3等。

图7 KEGG分析结果柱状图

图8 KEGG分析结果散点图

图9 Human cytomegalovirus infection信号通路图

3 讨论

目前AD发病机制尚未明确，临床治疗存在一定难度。美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准的药物只有两类:胆碱酯酶抑制剂以及NMDA受体拮抗剂(美金刚)[4]，这两种药物只能一定程度上缓解AD的症状但并不能治愈AD。其他类型的药物有许多仍在临床实验中,还有部分药物由于多种原因已经终止[5]。基于中医药理论和临床实践，AD病情进展中固本健脑液治疗病机可概括为气虚→痰凝→血瘀→津停[6]，具有补脾益肾、化痰祛瘀、健脑益智等功效,契合AD病机。

“成分-靶点-通路”网络显示IL-6、EGFR、NFKBIA、TNF、Fas、FADD、CASP8、BAX、CASP9、CASP3等靶点的Degree值排在前位，提示这些靶蛋白很可能在固本健脑液治疗AD中的人巨细胞病毒感染信号通路中发挥着关键作用。Il-6主要由神经元和胶质细胞组成，刺激小胶质细胞和星形胶质细胞释放炎症因子。Il-6通过增加神经元APP mRNA的表达来增加APP的产生[7]。IL-6还通过诱导α2巨球蛋白的合成，抑制脑组织清除Aβ，导致脑组织Aβ的异常沉淀。TNF是通过抑制TNF诱导的神经炎症以促进神经元存活而成为AD的另一治疗靶点[8]。TNFR1、TNF相关细胞凋亡诱导配体受体1(TRAIL1)和Fas都属于死亡受体，TNF激活TNFR1后,TNFR1相关死亡结构域蛋白(TNFR1-associated death domain protein,TRADD)与胞内的Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)和caspase 8相关联,形成死亡诱导信号复合物,能够促进procaspase 8成为其活性形式caspase 8,从而触发caspase级联反应,这个级联反应能够激活下游的Caspase相关蛋白酶诱导细胞凋亡[9]。另一方面，Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bax和Bak，使线粒体释放Cyt C到胞浆从而引发Caspase-9前体及Caspase-3活化,后者剪切靶细胞的功能蛋白质导致细胞凋亡[10]。

本研究基于网络药理学方法对固本健脑液多成分、多靶点、多通路的相互作用规律和调控网络进行了挖掘和分析，通过建立药效成分-靶点通路网络图，多角度探索固本健脑液防治AD潜在的作用机制，发现固本健脑液中的灌木远志酮A、川芎哚、7，9(11)-去氢茯苓酸甲酯等活性成分可能通过抗感染、抗细胞凋亡、减少炎症反应等机制发挥治疗AD的作用。为其后续临床试验疗效评价指标的筛选提供依据和方向。同时，对于文献中证明有治疗AD作用的部分化合物，本研究并未筛选得到，说明实验方法还存在一些局限性，网络药理学研究结果仍需要后续实验的验证与支持，并不断完善。