红心火龙果果肉中活性成分与其抗氧化能力的相关性研究

肖默艳,黄燕芬,王东伟,赵 雷,王 凯,胡卓炎

(华南农业大学食品学院,广东广州 510642)

火龙果(HylocereusundatusBritt)又称红龙果、仙蜜果,是仙人掌科(Cactaceae)量天尺属(Hylocereusundatus)和蛇鞭柱属(Seleniereusmejalantous)植物,按果皮果肉颜色主要分为红皮白肉、红皮红肉、黄皮白肉3大类[1]。红皮红肉火龙果果实中富含甜菜红素,还含有多酚和黄酮等天然活性成分,近年来逐渐受到人们的关注。

研究表明甜菜红素、多酚和黄酮这三类物质均能清除自由基及减少自由基的形成,其结构、含量与生物活性具有良好的相关性[2-5],而不同植物中这三类物质存在极大差异。目前诸多关于火龙果色素提取物抗氧化活性的研究,鲜有探讨提取物中存在与甜菜红素结构及性质相似的多酚和黄酮类物质的作用。甜菜红素的化学结构与抗氧化活性关系密切,但火龙果中主要色素Betanin和Phyllocactin的活性差异尚未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

红肉火龙果(HylocereusundatusBritt) 均为食用成熟期的市售水果,具体产地及品种见表1;ABTS(2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐) 分析纯,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼自由基) 分析纯,梯希爱(上海)化成工业发展有限公司;三吡啶三吖嗪 分析纯,上海麦克林生化科技有限公司;甲醇 色谱纯,默克试剂公司;甲酸 色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;其它试剂 均为国产分析纯。

表1 红肉火龙果的产地及品种Table 1 Origins and varieties of red dragon fruit

ME104E分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;KQ5200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;TD5-Ⅱ低速离心机 长沙平凡仪器仪表公司;UVmini-1240紫外分光光度计、LC-20AT高效液相色谱仪(配紫外检测器)、Uplc1290-6540B Q-TOF液相色谱-质谱联用仪 日本岛津公司;Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱 美国安捷伦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 红肉火龙果剥皮果肉打浆混匀,称取40.0 g果浆,按料液比1∶4 (g/mL)加入40%乙醇溶液[6],在提取温度30 ℃、超声波功率100 W条件下提取20 min,在3500 r/min下离心15 min,取上清液,4 ℃冷藏备用。

1.2.2 甜菜红素含量测定 参考Herbach等[7]的方法。取1 mL提取液于100 mL容量瓶中,蒸馏水定容至刻度,摇匀,分别在波长537、600 nm处,以蒸馏水为空白,测定其在两波长处的吸光度。

式中:A为537 nm所测定的吸光度减去600 nm所测定的吸光度;Mw为甜菜苷的相对分子质量(Mw=550 g/mol);DF为稀释倍数;ε为甜菜红素的摩尔吸收率(ε=60000 L/(mol·cm));l为比色皿的厚度。

1.2.3 总酚含量测定 采用Folin-Ciocalteu法测定提取液的总酚含量[8],配制0～1000 mg/L的没食子酸系列标准溶液,分别取0.1 mL标液于10 mL容量瓶内,加0.5 mL福林酚溶液,室温下反应3～4 min,加入1.5 mL的20%碳酸钠溶液,以水定容至刻度混匀后室温下反应2 h,在765 nm处测定吸光值,以标准溶液浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,得标准曲线:y=0.0011x+0.0067,R2=0.998。取0.1 mL提取液按此方法测得吸光度,代入标准曲线,计算提取液中总酚含量。由于该反应试剂会氧化甜菜红素的酚羟基,故此法测得的含量减去甜菜红素含量,为除甜菜红素外的总酚含量(mg/L)。

1.2.4 黄酮含量测定 总黄酮含量的测定参考Phongtongpasuk等[9]方法,稍作修改。配制0～40 mg/L芦丁系列标准溶液,分别取1 mL标液于10 mL容量瓶,加4 mL 30%乙醇溶液,混匀,加0.3 mL5%亚硝酸钠溶液,混合后放置5 min,加0.3 mL10%的硝酸铝溶液,混合后放置5 min,加入3 mL1 mol/L NaOH溶液,并用30%乙醇定容至刻度,反应15 min后测定510 nm处的吸光值,以标准溶液浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,得标准曲线:y=11.723x-0.0027,R2=0.9991。取1 mL提取液按此方法测得吸光度,代入标准曲线,计算得样品中总黄酮含量为每升提取液中芦丁的含量(mg/L)。

1.2.5 体外抗氧化活性测定

1.2.5.1 总抗氧化能力的测定 参照Benzie等[10]的方法,FRAP工作液由10 mmol/L Fe3+-三吡啶三吖嗪溶液、20 mmol/L氯化铁溶液以及0.3 mol/L,pH3.6的醋酸盐缓冲液按1∶1∶10混合组成,配制0～1 mmol/L硫酸亚铁标准溶液,分别取100 μL标液于棕色试管中,加入3 mL的FRAP工作液,混匀,37 ℃下反应10 min后于593 nm处测定吸光值,以标准溶液浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,得标准曲线:y=0.6353x+0.0178,R2=0.9981。并将相应的硫酸亚铁浓度(mmol/L)定义为FRAP值,作为总抗氧化能力的活性单位(U)。取100 μL提取液按此方法测得吸光度,代入标准曲线进行计算,总抗氧化能力以每毫升提取液中含有的活性单位表示(U/mL)。

1.2.5.2 清除DPPH·能力的测定 参照张素芳等[11]的方法,取4 mg DPPH,以95%乙醇溶解后,定容至100 mL棕色容量瓶,制得DPPH反应液。取1 mL 95%乙醇,加4 mL DPPH反应液,避光反应30 min,在517 nm波长处测定其吸光值,记为A0;分别取1 mL稀释2～7倍后的提取液,加4 mL DPPH反应液,反应和测定方法同上,测得吸光值记为A1;分别取1 mL稀释2～7倍后的提取液,加4 mL 95%乙醇溶液,反应和测定方法同上,测得吸光值记为A2。根据以下公式计算DPPH·清除率:DPPH·清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0,以稀释倍数和DPPH·清除率拟合线性方程,将对DPPH· 50%清除率定义为1个活性单位(U),清除DPPH·能力以每mL提取液中含有的活性单位来表示(U/mL)。

1.2.5.3 清除ABTS+·能力的测定 参照Huang等[12]的方法,ABTS+·反应液由7.4 mmol/L ABTS溶液和2.6 mmol/L过硫酸钾水溶液等体积混合,4 ℃避光反应,静置过夜后获得。使用前用乙醇稀释到吸光值在734 nm处为0.70±0.02。取1 mL 95%乙醇溶液,加4 mL的ABTS+·反应液,避光反应10 min后在734 nm波长处测定其吸光值,记为A0;分别取1 mL稀释2～14倍后的提取液,加4 mL的ABTS+·反应液,测定方法同上,测吸光值记为A1;再分别取1 mL稀释2～14倍后的提取液,加4 mL的95%乙醇,测定方法同上,测吸光值记为A2。ABTS+·清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0,以稀释倍数和ABTS+·清除率拟合线性方程,将对ABTS+· 50%清除率定义为1个活性单位(U),清除ABTS+·能力以每mL提取液中含有的活性单位来表示(U/mL)。

1.2.5.4 清除·OH能力的测定 参照黎海利等[13]的方法,5 mL反应体系中含1 mL 10 mmol/L硫酸亚铁溶液、2 mL 5 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、1 mL 0.1%的H2O2溶液和1 mL稀释1～2倍后的提取液,37 ℃反应30 min,在510 nm 波长处测得吸光度A1;去离子水代替提取液测得A0;去离子水代替H2O2测得A2。·OH自由基清除率(%)=[A0-(A1-A2)]/A0,以稀释倍数和·OH清除率拟合线性方程,以·OH 50% 的清除率定义为1 个活性单位(U),清除·OH能力以每mL提取液中含有的活性单位来表示(U/mL)。

1.2.6 甜菜红素成分分析及结构鉴定 参考Faridah等[15]方法,稍作修改。采用高效液相色谱法,色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱;流动相A:0.4%甲酸-水溶液,流动相B:甲醇;梯度洗脱时间程序:0～5 min,10% B;5～30 min,10%～40% B;30～35 min,40%～90% B;35～40 min,90%～10% B;柱温为30 ℃;流速为1 mL/min;进样量为20 μL;检测器为紫外检测器,检测波长为538 nm。

采用液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS)对各甜菜红素组分进行鉴定[16]。液相条件如上所述,质谱条件为ESI离子源,正离子扫描,扫描范围m/z:105～1700,干燥气体温度300 ℃,干燥气体流速9 L/min,碎裂电压150 V。根据各甜菜红素组分的质谱碎片信息,对其进行初步鉴定。

1.3 数据处理

试验重复三次,采用IBM SPSS Statistics 20软件对所有数据进行邓肯氏单因素方差分析(P<0.05)、和Pearson相关性分析,运用SIMCA-P 11.5软件进行偏最小二乘回归分析。

2 结果与分析

2.1 不同火龙果果肉活性成分与抗氧化能力的单因素方差分析

不同品种和产地的红心火龙果果肉提取液中活性成分含量及抗氧化能力存在差异,结果见表2。

表2 不同火龙果果肉的活性成分含量和抗氧化能力Table 2 Active ingredient content and antioxidant properties of different red dragon fruit

由表2结果可知,“海南金都1号”火龙果中甜菜红素和黄酮含量最高,分别为76.77和9.00 mg/L,显著高于其他“金都1号”和“蜜宝”品种的火龙果(P<0.05)。而“广西大红龙”火龙果中总酚含量最高,为53.01 mg/L,显著高于除“广西金都1号”外的其他样品(P<0.05)。“广州蜜宝”提取液的活性成分含量均显著高于“海南蜜宝”(P<0.05)。

2.2 不同火龙果果肉活性成分与抗氧化能力的相关性分析

表3 不同火龙果果肉活性成分和抗氧化能力之间的相关性分析Table 3 Correlation analysis between active constituents and antioxidant capacities of different red dragon fruit

2.3 不同火龙果果肉中甜菜红素成分分析及结构鉴定

不同品种和产地火龙果果肉中甜菜红素成分的HPLC分析,色谱图如图1所示。

图1 不同品种和产地火龙果果肉中甜菜红素组成的高效液相色谱图Fig.1 High performance liquid chromatograms of betalaincompositions in dragon fruit from different varieties and origins注:1:betanin;2:isobetanin;3:phyllocactin;4:isophyllocactin。

利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件(2004A)进行色谱峰的校正、匹配,确定4个共有峰。将图中4个共有色谱峰作为特征峰,利用HPLC-MS进行结构鉴定,检测得一级质谱图和二级质谱图,结果如图2。

如图2(a)所示,特征峰1的保留时间为17.683 min组分的[M+H]+为551.1519,相对分子质量550.1519,初步推断为Betanindin-5-O-β-glucoside(Betanin)。二级质谱中389.0979碎片是由Betanin脱去β-glucoside、150.0549是脱羧脱氧的甜菜醛氨酸,此两个碎片信息进一步验证了其为Betanin。如图2(b)所示,特征峰2的保留时间为19.248 min组分的[M+H]+为551.1509,根据Stintzing等[17]的研究结果,推测是第一个组分的同分异构体Isobetanindin-5-O-β-glucoside(Isobetanin)。二级质谱碎片有389.0985、345.1071和150.0553,其中345.1071是由Isobetanin脱去β-glucoside和两个羧基,进一步验证推测。

如图2(c)和(d),特征峰3和4的保留时间为22.736和23.738 min两个组分的[M+H]+分别为637.1542和637.1515,根据Herbach等[18]研究结果,推测这两个组分分别为Phyllocactin和Isophyllocactin。二级质谱碎片均在593、389、278左右,其中593左右的碎片是由它们脱去羧基,389左右碎片是由它们脱去丙二酰基和β-glucoside,278左右的碎片是丙二酰β-glucoside的结合物,由此验证了推测的结论。

图2 火龙果果肉中甜菜红素一级质谱图和二级质谱图Fig.2 First-order mass spectrums and secondary mass spectrums of betalain in pitaya注:特征峰1(保留时间17.683 min)的一级质谱图(a1)和二级质谱图(a2);特征峰2(保留时间19.248 min)的一级质谱图(b1)和二级质谱图(b2);特征峰3(保留时间22.736 min)的一级质谱图(c1)和二级质谱图(c2);特征峰4(保留时间23.738 min)的一级质谱图(d1)和二级质谱图(d2)。

根据Herbach等对 Betanin和Phyllocactin描述的化学结构式的分析[19],表明Isobetanin和Isophyllocactin分别是Betanin和Phyllocactin C-15位手性碳原子的反式结构。

2.4 甜菜红素的单体化合物含量与抗氧化活性的相关性分析

2.4.1 不同火龙果果肉中甜菜红素单体化合物的单因素方差分析 以HPLC检测不同火龙果提取液中甜菜红素色谱图的峰面积表示各物质的相对含量,结果见表4。不同火龙果样品中总甜菜红素含量以及四种组分物质含量均呈显著性差异(P<0.05),Betanin、Isobetanin、Phyllocactin以及Isophyllocactin均在“广西大红龙”中含量最高,但“广西桂红龙1号”中所含的Isobetanin及Isophyllocactin与“广西大红龙”中含量无显著性差异(P>0.05)。

表4 不同火龙果果肉中甜菜红素组成及相对含量Table 4 Composition and relative content of betalain in different pitaya

甜菜红素的化学结构与抗氧化活性关系密切,其基本结构包含一个葡糖苷化的酚羟基和环胺基团,是良好的电子供体,具有较强的抗氧化活性[20],且随着羟基或亚胺基数量的增加抗氧化活性增强[21],其中邻苯二酚是重要的活性基团[22]。但尚未报导酰基化后的Phyllocactin和Betanin之间抗氧化活性强弱,为避免通过各种活性物质精确分离后进行抗氧化效果对比研究的复杂繁琐过程,采用偏最小二乘回归法进行分析。

2.4.3 变量投影重要性分析 偏最小二乘回归分析的结果由自变量的标准回归系数和变量投影重要性(VIP)值来综合评价。标准化回归系数的绝对值越大,在回归方程中的权重就越大,该自变量对因变量的影响也就越显著[23]。若自变量的标准化回归系数为正,则与因变量呈正相关,反之则为负相关。VIP 图的纵坐标值越大,说明该自变量对因变量的贡献越大(图3)。

图3 PLSR方程的变量投影重要性图Fig.3 Variable importance values of PLSR equation 1,2,3,4

3 结论

抗氧化活性与测试体系密切相关,不同评价体系,反应原理不一,评价结果有时存在较大差异。火龙果果肉液中含有多种类型的活性成分,由于其结构不同,在不同的抗氧化体系中作用也显示不同。所以,采用5种抗氧化方法,更能客观真实地反应火龙果提取物的抗氧化能力。本研究发现,不同火龙果果肉液中活性成分的含量存在一定差异,使得提取液的抗氧化活性也差异显著(P<0.05),“海南金都1号”火龙果中甜菜红素和黄酮含量均最高,分别为76.77和9.00 mg/L,“广西大红龙”中总酚含量最高,达53.01 mg/L。“海南金都1号”总抗氧化能力最高,达39.02 U/mL,“广西桂红龙1号”清除·OH能力最高为2.18 U/mL。Pearson相关性分析发现,除·OH清除能力外,甜菜红素含量与其他4种抗氧化能力具有极显著正相关(r=0.936～0.955),黄酮含量与各抗氧化能力间相关性较强(r=0.717～0.956),而总酚与抗氧化能力无显著相关性(P>0.05)。