横向骨搬移技术对缺血肢体术区微循环重建的实验研究

2020-06-18方志远王成伟王雪李飞

中国骨与关节杂志 2020年6期

方志远王成伟王雪李飞

肢体缺血是一种常见且多发于下肢的临床症状。在我国造成肢体缺血的主要病因是动脉粥样硬化闭塞症、血栓闭塞性脉管炎和糖尿病足等。下肢动脉硬化闭塞症的发病率为 10%。随着年龄的增长，其发病率呈上升趋势，70 岁以上人群的发病率在 15%～20%。下肢缺血的主要临床表现为下肢凉、麻木、无力、间歇性跛行、静息痛和肢体缺血性溃疡、坏疽等[1]。因其临床表现严重，出现严重的间歇性跛行或静息痛，肢体远端缺血坏死或溃疡，被迫截肢的危险性相对较高[2]。

近年来有临床研究显示，基于横向骨搬移技术的牵拉组织再生的原理，骨瓣的横向牵拉可以促进组织内微血管网络的形成，从而改善患肢的的血液循环达到治疗目的[3-4]。叶锋等[5]，王召华等[6]及花奇凯等[7]国内众多知名学者使用横向骨搬移技术促进了下肢末梢溃疡面的愈合。横向骨搬移技术利用骨组织创伤后需要血管再生这一特点，达到重建血液循环，使下肢血流量增加，从而治疗下肢血液循环障碍疾病。目前，此项基础研究尚处于起步阶段，国内外的相关文献较少[8-9]。病例报道及动物实验研究均表明胫骨横向搬移术对治疗下肢缺血性疾病确有明显疗效，但具体机制及其相关理论都有待于进一步研究证实[10]。该实验旨在研究横向骨搬移术区的微循环的变化，为进一步探讨横向骨搬移术的良好治疗效果的分子生物学机制奠定基础。

资料与方法

一、资料

1. 实验动物：选取 6 只 12 月龄比格犬，均为雌性，体质量 15.0～16.0 kg，平均 ( 15.7±0.6 ) kg，身长 ( 55±2 ) cm，胫骨长度平均为 ( 11.0±0.8 ) cm，体格健康、适中，由新疆医科大学动物实验中心提供，许可证号：SYXK ( 新 ) 2018-0002。此次研究已取得新疆医科大学动物实验伦理委员会授权。

2. 设备：兽用红外线体温计 ( D-688 型康宁公司 ) 器械包 ( 新疆医科大学第六附属医院 )。选用Siemens AXIOM Artis MP 多功能血管造影机，30 ml注射器，18G 静脉留置针 ( 1.3 mm×30 mm，苏州林华公司 )，对比剂选用碘帕醇注射液 ( 300 g / L，北京北陆公司 )。病理取材台 ( 深圳市成科实验室设备有限公司 )；包埋热台 ( 徕卡 LEICAEG 115067 )；包埋冻台 ( 武汉汉谷医疗科技有限公司 HB-P3 )；脱水机 ( 徕卡 DT-2000B )；石蜡切片机 ( 徕卡 LEICARM 2135 )；烤片机 ( 恒宇 G2X-DH·300BS )；漂片机 ( 徕卡 HI1210 )；奥林巴斯相差显微镜 ( 日本OLYMPUS 6F41110 )；染色机 ( 新疆美奥尔康仪器有限公司 )。

3. 双下肢缺血动物模型制备：应用国内、外肢体缺血模型建立的方法[11]。于 2018 年 9 月至 2019年 4 月依次选取比格犬对其进行双后肢胫前动脉结扎术，将左后肢定为对照组，右后肢定为搬移组。由同一名高年资医师完成胫前动脉结扎术及对比格犬进行胫骨横向骨搬移术。( 1 ) 给予比格犬适应性喂养 3 天；( 2 ) 6 条比格犬均通过结扎双侧后肢胫前动脉建立缺血模型；( 3 ) 结扎胫前动脉后 1 天双后肢行双下肢血管造影 ( digital subtraction angiography，DSA )，再次确认双下肢血管是否完全被结扎以明确下肢血管侧支循环建立情况；( 4 ) 给比格犬戴嘴套，防止安装搬移架之后犬撕咬搬移架情况的发生；( 5 ) 结扎胫前动脉后 1 天，安装横向骨搬移的特制牵引支架。无菌操作，于胫骨走向切开下肢皮肤，切口约 5 cm，在胫骨外侧中段先钻 2 小孔便于装上搬移支架，再用微型摆锯在胫骨外侧以 2 小孔为中心开窗，切取 3 cm×1 cm 骨块，避免损伤骨髓及周边软组织，将搬移支架固定于骨块上，缝合软组织及皮肤；( 6 ) 于对侧搬移组的搬移术区同一水平面，对照组行胫前动脉走向切开同样长度的下肢皮肤，切口约 5 cm，并缝合；( 7 ) 搬移组按胫骨横向骨搬移术实施胫骨的横向骨搬移[12]，并给予搬移组石膏固定，防止比格犬破坏搬移架。给予起旋特定搬移支架上的螺旋装置，使骨块每次向外搬移出0.35 mm / 次，2 次 / 天，间隔 4 h，搬移后 10 天，骨块搬移出 7 mm。再将骨块按此方式逆时针搬移后10 天骨块搬移回原位；( 8 ) 每日坚持喂食及测定双后肢的术区周围的皮温，观察横向骨搬移术后 21 天的 DSA 中的微动脉的数量及病理活检中的微动脉的数量及胫前动脉结扎后 1 天的上述指标的变化；( 9 )搬移完毕后 2 天处死比格犬。

二、指标检测

1. 一般情况：记录所有比格犬胫前动脉结扎建模后 5 天内自主活动情况。

2. 术区的皮温：检测所有比格犬双后肢术区周围的围术期搬移区的皮温。

3. 双后肢的 DSA：检测所有比格犬双胫前动脉结扎术后 1 天及实验犬行横向骨搬移术后 21 天的DSA。

4. 病理活检：检测所有犬行胫骨横向骨搬移术后 21 天的双下肢术区周围的病理活检。

三、统计学处理

采用 SPSS 20.0 统计软件对数据进行分析，应用完全随机样本的方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

1. 围术期的一般情况：6 条比格犬术后步态均正常 ( 图 1 )，未出现跛行。

2. 围术期术区的皮温比较：围术期期间，6 条实验犬搬移组的术区皮温可见明显变化，而对照组的术区皮温未见明显变化 ( 表1 )。

3. 双后肢术区的 DSA：将 6 条比格犬行双后肢 DSA。通过观察 DSA 影像，可发现 ( 1 ) 在搬移组中，横向骨搬移术后 21 天的术区微循环 ( 图 2a ) 明显较胫前动脉结扎术后 1 天的术区的微循环 ( 图 2b )丰富；( 2 ) 在对照组中，实验犬实行横向骨搬移术后21 天的术区的微循环 ( 图 2c ) 较胫前动脉结扎术后1 天的术区微循环 ( 图 2d ) 未见明显变化；( 3 ) 在实验犬行横向骨搬移术后 21 天，搬移组术区的微循环( 图 2a ) 明显较对照组术区的微循环 ( 图 2c ) 丰富。

4. 双后肢术区的病理活检：实验犬行横向骨搬移术后 21 天，行双后肢术区病理活检。通过病理活检的对比可发现，搬移组术区微循环数量 ( 图 3a )明显较对照组多 ( 图 3b )。

表1 对照组与搬移组的围术期术区皮温 (，±s，n = 6 )Tab.1 Perioperative skin temperatures of the control group and transfer group (, ±s, n = 6 )

组别结扎前结扎后搬移后 21 天 F 值 P 值对照组 32.5±0.5 32.1±0.3 32.3±0.2 1.895 0.185images/BZ_52_1530_1356_1533_1356.png搬移组 33.1±0.3 33.2±0.3 33.3±0.1 32.526 0.0002 t 值 2.521 0.577 10.954 - -P 值 0.030 0.576 0.0015 - -

图1 实验犬的术后步态观察 a～b：实验犬术后步态均正常Fig.1 Postoperative gait of experimental dogs a - b: Normal gait after operation

图2 双后肢术区的 DSA a：搬移组：横向骨搬移术后 21 天的术区微循环；b：搬移组中胫前动脉结扎术后 1 天的术区微循环；c：对照组：实验犬实行横向骨搬移术后 21 天的术区微循环；d：对照组中胫前动脉结扎术后 1 天的术区微循环Fig.2 Double hind limb DSA a: Microcirculation of the transfer group 21 days after transverse bone transfer; b: Microcirculation of the transfer group 1 day after tibial artery ligation; c: Microcirculation of the control group 21 days after transverse bone transfer; d: Microcirculation of the control group 1 day after tibial artery ligation

图3 实验犬行横向骨搬移术后 21 天双后肢术区的病理活检a：对照组的术区病理活检；b：实验组的术区病理活检Fig.3 Double hind limb pathological biopsy 21 days after transverse bone transfer a: Pathological biopsy of the control group; b:Pathological biopsy of the transfer group

讨论

下肢缺血性疾病主要包括血栓闭塞性脉管炎和动脉硬化性闭塞症[5]。目前，临床上治疗血栓闭塞性脉管炎的方式包括保守药物治疗和微创血管介入，其疗效有待进一步提高，因此患者必须接受手术治疗[13]。选用股、-远端胫动脉旁路转流术，腰交感神经切除术或大网膜移植术、动静脉转流术、腔内血管成形术或横向骨搬移技术。其中，横向骨搬移技术在治疗肢体缺血疾病中的疗效最优[14]。

横向骨搬移技术的原理是通过拉力效应反复刺激胫骨骨髓，血管内皮细胞的有丝分裂和组织再生，从而重建血液循环并避免截肢[15]。目前，临床上治疗下肢微循环闭塞疾病的方式包括保守药物治疗和微创血管介入，其疗效有待进一步提高，因此患者必须接受手术治疗[13]。尽管横向骨搬移技术对骨块的搬运以及血管再生和循环重建在临床上仍处于促进阶段，但已广泛认识到该术式可刺激软组织的再生[16]。横向骨搬移技术作为微循环重建技术的临床应用之一[17]，既是对显微外科的一种拓展，也是对微血管再生技术的突破；横向骨搬移技术在治疗下肢缺血性疾病时组织微循环得到有效的改善[18]。但在国内外针对横向骨搬移技术的动物实验报道甚少[8-9]，国内外学者对横向骨搬移技术能促进微循环再生的机制尚未有统一的解释。本研究通过动物实验，对横向骨搬移技术的手术区域的微循环变化进行了进一步的基础研究，旨在为进一步深入研究横向骨搬移技术的良好治疗效果的分子生物学机制奠定基础。

一、双后肢术区的皮温

通过观察 6 条实验犬行横向骨搬移术后 21 天的双后肢的术区皮温较胫前动脉结扎后 1 天的双后肢术区皮温的变化情况发现，在搬移组中，实验犬行横向骨搬移术后 21 天的术区皮温较胫前动脉结扎术后 1 天的术区皮温明显增高；而在对照组中，实验犬行横向骨搬移术后 21 天的术区皮温未较胫前动脉结扎术后 1 天的术区皮温增高，故侧面反映了实验犬行横向骨搬移术后 21 天搬移组的术区微循环明显较胫前动脉结扎术后 1 天的术区微循环增多。此结果与徐浩博教授通过横向骨搬移技术治疗 7 例血栓闭塞性脉管炎患者的治疗中，所发现的横向骨搬移术的术区的皮温增高的结论相吻合[5]。Zuo 等[18]也在对 90 例下肢慢性缺血性疾病患者的治疗中发现，横向骨搬移技术可有效升高下肢温度，有助于下肢的血运重建，并改善患者的临床症状。

二、双后肢术区的 DSA

通过对比搬移组横向骨搬移术后 21 天的 DSA与胫前动脉结扎术后 1 天的 DSA，可见搬移组术区于横向骨搬移术后 21 天的微循环明显较胫前动脉结扎术后 1 天的微循环丰富。再通过实验犬胫骨横向骨搬移术后 21 天的搬移组术区的 DSA 与对照组术区的 DSA 对比，可见搬移组术区的微循环明显较对照组术区的微循丰富，且通过对比实验犬胫骨横向骨搬移术后 21 天的对照组术区的 DSA 与胫前动脉结扎术后 1 天的对照组术区的 DSA，发现实验犬于横向骨搬移术后 21 天的微循环数量与胫前动脉结扎术后 1 天的对照组术区的微循环数量未见明显变化。提示横向骨搬移技术能明显促进缺血实验犬的横向骨搬移术区的微循环再生。该研究结果与曲龙教授应用横向骨搬移技术治疗 1 例血栓闭塞性脉管炎患者时，通过对该患者双下肢 DSA 所发现的横向骨搬移术区周围形成了丰富的血管网络的结论相符合[11]。