基于TGF-β1/Smad3信号通路观察rb-bFGF在糖尿病大鼠烧伤创面愈合中的作用机制

张萍，蒋仕秋，陈雪莲，王宽，刘漪沦

糖尿病(DM)合并难愈合创面是常见的糖尿病并发症之一[1]。其病程长、难以治愈、截肢率高，严重影响了患者的生活质量[2-3]。临床中已有多种药物治疗糖尿病性皮肤创面，且具有治愈率高、无新生创面、不良反应低等特点，其中重组牛碱性成纤维细胞生长因子(rb-bFGF)作为一种最常见的外用药物之一，在促进组织修复及创面愈合中发挥重要的作用，但其作用机制尚不完全明确[4]。TGF-β1/ Smad3 (Smad3蛋白)信号通路是创面愈合中最重要的调控途径[5]。TGF-β1广泛介导细胞的多种功能，其根据细胞活化或分化程度的不同，双向调节目的细胞功能，促进创面的愈合；Smad3蛋白是TGF-β1最重要的细胞内信号转导蛋白[6]。因此本研究通过糖尿病大鼠烫伤模型制备糖尿病难愈合创面，观察TGF-β1/Smad3信号通路关键蛋白的表达变化，以揭示rb-bFGF在创面愈合中的作用机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物：无特定病原体(SPF)级雄性 SD 大鼠100只，8～10周龄，体质量200～250 g，由北京中医药大学实验动物中心提供(许可证号2019-0005A)；依照北京中医药大学实验动物管理办法，室温下标准饲料、自由饮水、分笼(4笼)适应性饲养1周后用于实验。(2)试药试剂：rb-bFGF(珠海亿胜生物制药有限公司生产)，人重组 TGF-β1 购自美国 Peprotech公司，HE染色检测试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，免疫组化试剂盒购自美国Amresco公司，Western-blot试剂盒购自Santa Cruz公司，TGF-β1、Smad3单克隆抗体购自美国CST公司，链脲佐菌素(STZ)购自华北制药厂。(3)仪器：CellInsight激光共聚焦显微镜(Thermofisher生产)，E-Gel Imager凝胶成像仪(美国Beckma公司生产)，DM2500生物电镜(德国徕卡公司生产)，Multiskan MK3酶标仪(美国Fermentas公司生产)，血糖仪(美国Johnson公司生产)。

1.2 实验方法 2018年3—9月于成都医学院第一附属医院科研实验中心进行实验。 SD大鼠100只随机数字表法分为对照组、模型组、TGF-β1组、实验组，每组25只。对照组大鼠仅予标准饲料喂养；模型组、TGF-β1组、实验组大鼠高脂高糖饲料喂养1个月后，按STZ 50 mg/kg大鼠腹腔注射，对照组注射等体积无菌生理盐水；3 d后，尾静脉血糖仪测血糖，空腹血糖>16.7 mmol/L即DM大鼠模型构建成功；建模后第10天，所有大鼠以20%乌拉坦5 ml/kg腹腔注射麻醉，而后在其背部距肩胛骨下2 cm处用手术剪剪毛3 cm×3 cm，并用8%硫酸钠脱净残留毛发，75%乙醇消毒处理，各组大鼠用直径为2.5 cm的圆形烫伤仪探头烫伤脱毛区皮肤，形成紧邻筋膜的全层皮肤缺损圆形创面，并即刻皮下注射醋酸氢化可的松0.6 mg/kg，另腹腔注射乳酸林格氏液 5 ml 抗休克。烫伤后当天分组给药：对照组、模型组不进行药物干预，使用生理盐水清洗创口，医用无菌纱布覆盖；TGF-β1组烫伤创面下注射TGF-β1(5 ng/ml)0.5 ml；实验组涂抹rb-bFGF，医用无菌纱布覆盖伤口。模型组、TGF-β1组、实验组大鼠在实验过程均有伤亡2～3只，每组随机选取22只作为观察对象。造模成功后，每周随机检测血糖1次，尾静脉每3天补充注射STZ 5 mg/kg，将大鼠血糖控制在16.7～22.0 mmol/L内，防止在实验过程中大鼠因血糖过高而死亡;烫伤后第28天清晨处死大鼠取创面组织标本放入-20℃冰箱中保存，进行病理学检测。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 手术创面愈合情况：烫伤后第5、14、28天，以数码相机拍照并记录创面的愈合情况，包括创面颜色及质地、肿胀程度、新生上皮覆盖、有无渗出等。采用HVviewing8.0图像分析软件测定溃疡创面面积，计算创面愈合率。创面愈合率=(初始创面面积-尚未愈合创面面积)/初始创面面积×100%。

1.3.2 创面组织生态学变化：取每组大鼠30%创面组织，用5%甲醛固定，依照常规方法制成创面组织切片，HE染色，二甲苯处理，切片透明后，使用显微镜观察创面组织的生态学变化，包括毛细血管生长分布、胶原蛋白及上皮组织再生、炎性细胞浸润等情况。

1.3.3 超微病理结构：取每组大鼠50%创面组织，用30%聚甲醛和0.05%锇酸将其固定1 h，无菌脱水5 min，置于预冷4℃乙醇3 min,环氧树脂812浸透5 min，石蜡包埋，醋酸双氧铀及枸橼酸铅进行双重染色，制成50 nm厚切片， 完全干燥后载于铜网上，透射电镜观察超微病理结构。

1.3.4 α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达检测：取每组大鼠10%创面组织，10%多聚甲醛固定，石蜡包埋并切片，按照免疫荧光试剂盒要求进行操作。在荧光显微镜下，有红色荧光表示α-SMA表达，蓝色荧光为细胞核染色，使用计算机采集荧光图像，Image J软件重叠红绿荧光，将合成荧光的红、蓝色荧光光密度比值作为荧光强度值，随机选取6个高倍视野计算样品的平均荧光强度值。

1.3.5 TGF-β1、Smad3蛋白表达检测：采用蛋白免疫印迹Western-blot法检测。取每组大鼠10%创面组织，提取目标蛋白样品，经BCA试剂盒测定蛋白浓度后，准确量取50 μg，进行十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将样品蛋白经湿转法转至PVDF转膜上，加入10%脱脂奶粉封闭3 h，将一抗以1∶1 500比例稀释后，维持4℃过夜孵育，洗涤加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗孵育3 h， 增强化学发光ELC显色30 min，经曝光、显影、定影后，以GAPDH为内参来表示蛋白的表达水平。

2 结 果

2.1 各组大鼠创面愈合情况比较 各组大鼠手术后创口均无明显感染，随时间推移，大鼠创面逐步愈合。在烫伤28 d后对照组大鼠创面基本愈合；模型组大鼠创面颜色较深，周围组织出现部分水肿，已经好转；TGF-β1组创面明显缩小；实验组创面很小，已有少部分开始愈合。 与对照组比较， 模型组创面愈合率明显降低(P<0.05)；与模型组比较，TGF-β1组、实验组创面愈合率明显升高(P<0.05)，但2组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、图1。

2.2 各组创面组织生态学变化比较 对照组创口面新生胶原纤维增多，成纤维细胞团状排列，少量出现新生毛细血管。模型组炎性细胞明显增多，成纤维细胞排列紊乱，未见新生毛细血管。TGF-β1组少量淋巴细胞出现，但成纤维细胞致密分布在毛细血管周围，新生毛细血管少量出现。实验组中成纤维细胞肥大，且密集分布，胶原纤维清晰可见，新生毛细血管呈小圆状，并且已有开始生长的趋势，见图2。

2.3 各组创面组织超微结构比较 对照组大鼠细胞器数量多，细胞核质界限分明，内质网数量多，成纤维细胞数量多，新生胶原纤维较多；与对照组比较，模型组细胞内内质网开始扩张，线粒体空泡，核质间隙不清晰；与模型组比较，TGF-β1组病理改变明显减轻，其内质网基本不扩张，细胞器数量丰富，新生胶原纤维较多；实验组与TGF-β1组相似，细胞内细胞器数量丰富，内质网扩张不明显，核质间隙清晰，新生胶原纤维较多，见图3。

2.4 各组α-SMA蛋白质表达比较 烫伤后28 d，与对照组比较，模型组大鼠创面组织α-SMA蛋白表达明显降低 (t=8.643，P=0.000)；与模型组比较，TGF-β1组和实验组α-SMA蛋白表达均升高(F=15.392,P=0.000)，但2组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图4、图5。

2.5 各组TGF-β1、Smad3蛋白表达比较 Western-blot检测结果显示，与对照组比较，模型组TGF-β1、Smad3蛋白表达水平明显降低,差异有统计学意义(t=4.632、9.493，P=0.002、0.000)；与模型组比较，TGF-β1组、实验组TGF-β1、Smad3蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义(F=16.283、28.832,P均=0.000)，但2组间比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图6。

表1 各组大鼠不同时间点创面愈合率比较

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

图1 各组大鼠各时间点创面愈合情况

图2 各组大鼠创面的组织生态学变化(HE染色，×800)

图3 各组大鼠造模后第28天后创面组织超微结构特点(×1 500)

图4 各组大鼠创面组织α-SMA蛋白表达比较(×400)

3 讨 论

糖尿病皮肤病变是多因素、多环节参与，涉及表皮、皮下细胞及信号转导等的病理过程[7]。由于治疗困难、反复不愈，目前有25%患者面临截肢风险，是糖尿病患者致残的最大因素[8]，严重影响患者的生活质量。糖尿病患者因病变部位血液循环不畅，白细胞作用失常，伤口容易感染，且高血糖等特点加重伤口初期的炎性反应，影响胶原蛋白合成，伤口愈合受阻[9-10]。

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较， bP<0.05

注：与对照组比较，aP<0.05；与模型组比较， bP<0.05

有学者发现[11]，rb-bFGF治疗糖尿病创面，可以改善血液微循环，促进创面愈合。另有研究证明[12]，rb-bFGF能够促进创面上皮组织再生，促进创面毛细血管新生。本研究构建大鼠糖尿病皮肤烧伤模型，通过HE染色及透射电镜观察术后创面组织的病理学变化和超微结构变化，研究rb-bFGF对糖尿病皮肤创面愈合的作用。实验结果显示，表皮生长因子和rb-bFGF均有促进创面愈合的作用；TGF-β1组和实验组在显微镜下均可见毛细管新生、大量成纤维细胞，与模型组比较，rb-bFGF能提高糖尿病皮肤创面的愈合率(P<0.05)。α-SMA是肌成纤维细胞的重要标志物，在创面愈合过程中血管生成发挥着重要的作用[13]。创面伤口的愈合修复过程往往伴随伤口部位的收缩和瘢痕的形成，而肌成纤维细胞是形成伤口收缩的动力，α-SMA是导致伤口瘢痕收缩的基础，也是决定瘢痕最终结局的关键[14]。α-SMA的数量可以直接反映肌成纤维细胞的增殖状态，同时也是肌成纤维细胞中的特异性蛋白，与瘢痕的收缩功能相关[15]。本研究结果显示，与对照组比较，模型组中α-SMA表达量明显降低，rb-bFGF治疗后，α-SMA表达明显升高，其表达水平与TGF-β1组相近，说明rb-bFGF可通过促进血管生成达到治疗糖尿病皮肤创面愈合的疗效。

已有研究证明，导致糖尿病皮肤病变难愈的原因较为复杂，信号通路表达的变化是其中重要的因素之一。有报道称[16]，激活创面TGF-β1/Smad3信号通路，可促进上皮新生组织生成，加速伤口愈合。研究显示[17]，TGF-β1/Smad3信号通路是创面愈合的重要调控途径，TGF-β1是促进成纤维细胞的转化因子，能够促进上皮组织生成，加速组织修复。Smad3蛋白主要促进细胞内靶基因的表达，增强α-SMA的表达水平[18]。此外，Smad3蛋白还可加速细胞超微结构增生分化，维持细胞内环境稳定从而加速创面组织纤维化，促进平滑肌生长，多环节治疗难愈合创面；使创面组织短时间内进入细胞增生与迁移期，起到更好的抗炎、消肿作用[19]。本研究基于TGF-β1/Smad3信号通路探讨rb-bFGF促进糖尿病大鼠皮肤创面愈合的作用机制，实验结果显示，糖尿病创面模型大鼠经rb-bFGF治疗后，通路蛋白磷酸化水平均明显升高，提示rb-bFGF可能通过激活TGF-β1/Smad3通路，增强α-SMA蛋白的表达，促进创面愈合。本研究不足之处在于：(1)研究中通过烫伤皮肤构建糖尿病大鼠皮肤病变模型，其病理生理条件与糖尿病内源性皮肤病变模型存在不同之处，可能影响结论的准确性；(2)研究中评价了病理改变及通路调节机制，其不良反应的影响未深入探讨；(3)影响糖尿病皮肤病变的通路较多，rb-bFGF是否还能通过调节其他通路来影响疾病进程，仍需进一步的研究。

综上所述，rb-bFGF可促进糖尿病大鼠皮肤创面的愈合，其作用机制可能与TGF-β1/Smad3信号通路激活有关。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

张萍:设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；蒋仕秋:提出研究思路，分析试验数据，论文审核；陈雪莲、王宽:实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；刘漪沦：课题设计