靶向多肽SS-31对载脂蛋白E敲除动脉粥样硬化大鼠干预效果研究

汪洁，任何，党晶艺，张东伟，郝启萌

心脑血管疾病一直是全球发病率最高的疾病种类之一，具有较高的致残率和致死率[1-2]。动脉粥样硬化是一类以脂质代谢障碍为病变基础，以钙质沉着、动脉壁增厚变硬及血管腔狭窄为特征的慢性炎性疾病，对动脉粥样硬化机制的探究是防治心血管疾病的关键[3-5]。动脉粥样硬化的发生发展是一个十分复杂的过程，包括胆固醇代谢障碍、损伤反应、炎性反应、平滑肌增殖等都可能会对该进程产生影响[6-7]。现代分子生物学研究指出，动脉粥样硬化与血管内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞等促炎性细胞密切相关，巨噬细胞会吞噬脂质形成泡沫细胞，泡沫细胞进一步聚集形成坏死核心，促进动脉粥样硬化进程[8-9]。ApoE基因敲除大鼠多被应用于脂质代谢紊乱动物研究，其纤维斑块的形成与人类极其相似，可模拟人类动脉粥样硬化病理表现[10]。临床试验指出，SS-31对缺血再灌注损伤、神经退行性病变、胰岛素抵抗等均具有较好的治疗效果，但关于SS-31与动脉粥样硬化进程间的研究较少[11-12]。研究观察靶向多肽SS-31对ApoE敲除大鼠动脉粥样硬化的治疗效果，并分析其原因，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物及分组：选取8周龄的ApoE基因敲除雄性大鼠60只，SPF级，购自广州中医药大学实验动物中心[SCXK(粤)2013-0034]，体质量320～351(336.23±12.03)g。按照随机数字表法分为实验组与对照组，每组30只。2组大鼠均饲养于常规环境下，给予高脂饮食(0.2%胆固醇与20%脂肪混合型饲料)喂养。(2)仪器：奥林巴斯CX33光学显微镜，迈瑞BS-490 全自动生化分析仪，奥林巴斯OLS4100激光共聚焦显微镜，赛默飞Micro 17R/21R微量台式离心机。(3)试药与试剂：SS-31粉末购自苏州强耀生物科技技术有限公司，戊巴比妥 ATP试剂盒、SOD检测试剂盒购自艾美捷科技技术有限公司，一抗、二抗、CD36抗体、LOX-1抗体均购于英国Abcam公司。

1.2 实验方法 2018年12月—2019年4月于中国人民解放军空军军医大学第二附属医院实验动物中心进行试验。实验组大鼠以SS-31(粉末0.02 g加入生理盐水100 ml制成0.2 mg/ml药物溶液)5 ml·kg-1·d-1剂量皮下注射，对照组大鼠则予生理盐水5 ml·kg-1·d-1皮下注射，2组大鼠干预时间均为12周。12周后予2组大鼠腹腔注射戊巴比妥麻醉，经下腔静脉取血5 ml备用；加深麻醉后颈脱位处死，收集大鼠心脏及主动脉标本。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 标本处理： 心脏标本采用4%多聚甲醛固定1d后石蜡包埋，切片机连续切取10张，厚度6 μm； 主动脉窦冰冻切片置于丙二醇中静置2 min，油红O染色16 h，85%丙二醇分化1 min，苏木素染色3 min，封片，奥林巴斯CX33光学显微镜下观察并拍照。

1.3.2 主动脉斑块指标检测：上述标本处理中，大鼠10只实施主动脉弓染色，观测斑块面积及大小。

1.3.3 血脂和炎性指标检测：上述血液标本5 ml离心获得血清，采用迈瑞BS-490全自动生化分析仪检测血清三酰甘油(TG)和总胆固醇(TC)的含量；酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)检测血清细胞内黏附分子-1(intracellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、单核细胞趋化因子-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)。

1.3.4 氧化还原反应指标检测：上述标本处理中，主动脉窦冰冻切片(厚度6 μm)置于载玻片上，荧光探针(DHE，10 μmol/L，美国Sigma-Aldrich公司)37℃避光孵育30 min，奥林巴斯OLS4100激光共聚焦显微镜观察荧光，荧光强弱反映反应性氧化物(ROS)水平。主动脉离体后立即用ATP检测试剂盒及SOD检测试剂盒检测ATP水平及总SOD活性。

1.3.5 免疫组织化学指标检测：对大鼠主动脉标本切片实施脱蜡处理，抗原修复后对2组大鼠组织CD36及LOX-1表达进行检测；大鼠组织切片脱蜡，抗原修复，一抗、二抗(1∶200稀释)室温孵育，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色，苏木素复染。

2 结 果

2.1 2组主动脉斑块面积及大小比较 实验组大鼠的主动脉斑块面积(纵切面)及大小(横切面)均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 2组大鼠主动脉斑块面积及大小比较

2.2 2组血脂和炎性指标比较 2组TG及TC水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，而实验组大鼠血清ICAM-1及MCP-1水平均低于对照组(P<0.01)，见表2。

表2 2组大鼠血脂、炎性指标水平比较

2.3 2组主动脉ROS、SOD、ATP比较 实验组大鼠的ROS及SOD水平明显低于对照组，而ATP水平明显高于对照组(P<0.05)，见表3。

表3 2组大鼠主动脉氧化还原指标比较

2.4 2组主动脉CD36、LOX-1变化比较 实验组大鼠CD36及LOX-1表达均显著低于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表4。

表4 2组大鼠主动脉CD36、LOX-1比较

3 讨 论

据世界卫生组织调研指出，目前心血管疾病已成为死亡率最高的疾病之一，2004年全球约有1 710万人死于心血管疾病，死亡率约占全部疾病的29%，其中死于冠心病人数达720万人，死于卒中人数达570万人，世界卫生组织预测，到2030年，全球会有近2 360万人死于心血管相关疾病[13]。近些年随着我国人民生活水平的提升和人口老龄化趋势的显现，各类心血管相关疾病的发病率及病死率也有逐年递增趋势[14-16]。动脉粥样硬化是心血管疾病的主要病理基础，其病变受个体体质、后天环境等多种因素的影响[17]。其本质是以大量脂质和胆固醇聚集生成纤维斑块为特征的慢性炎性疾病。当前临床研究指出，炎性反应、胆固醇代谢异常、巨噬细胞泡沫化、脂质代谢障碍等都与动脉粥样硬化的发生发展存在一定关联[18]。

SS-31是一种能够自由渗入细胞，并靶向定位于线粒体的小分子肽，临床研究指出，SS-31能够清除线粒体内过多的ROS，减少ROS的产生，稳定线粒体膜电位，防止线粒体通透性的改变，进而阻止氧化应激诱导的细胞凋亡，SS-31对线粒体的保护作用已经在多个研究证实。学者通过将小鼠进行分组干预发现，小鼠后肢缺血再灌注会引起肌肉的炎性反应、氧化应激和线粒体功能损伤，进而诱导后肢骨骼肌细胞的凋亡，而SS-31的应用能够较好地保护线粒体功能，抑制组织炎性反应和氧化应激反应，对小鼠骨骼肌缺血再灌注损伤具有较好的预防和治疗作用[19-20]。朱娱等[21]的研究结果也显示，抗氧化剂SS-31能够降低脓毒症小鼠海马体组织中线粒体ROS水平，抑制细胞凋亡，改善损伤并降低小鼠病死率。

本研究就SS-31对ApoE敲除动脉粥样硬化大鼠干预效果进行分析，结果显示，相比对照组大鼠，应用SS-31干预的实验组大鼠主动脉斑块面积及大小均明显缩小，血清ICAM-1和MCP-1水平均明显降低，主动脉ROS、SOD、CD36及LOX-1表达下降，ATP水平上升，提示SS-31具有一定的改善动脉粥样硬化进程的效果。炎性反应在介导动脉粥样硬化病变进程中具有一定作用，内皮损伤是动脉粥样硬化的起始步骤，受损的内皮细胞会分泌大量的黏附因子和细胞因子[22-24]，上调巨噬细胞清除剂受体的表达，加快泡沫细胞的形成，有研究指出，动脉粥样硬化斑块处细胞内ICAM-1、MCP-1等因子都处于高表达状态[25-26]，本研究中SS-31的应用使ICAM-1、MCP-1水平出现下降，提示SS-31缓解了大鼠主动脉炎性反应，起到一定保护内皮血管的作用。多项研究都指出ROS生成增加会上调氧化应激水平，加快动脉粥样硬化进程，邹志勇等[27]的研究指出，ROS会损伤平滑肌细胞和内皮细胞的DNA，加快细胞衰老进程，导致细胞凋亡，而线粒体DNA损伤或线粒体功能失调又会进一步上调ROS水平，形成恶性循环。ATP水平可以直接反映线粒体功能，因而ATP水平的上升提示大鼠氧化应激反应有所缓解，CD36及LOX-1的水平也可以反映ROS的强度，因而本研究中实验组ATP水平的上升，CD36及LOX-1表达的下降都提示SS-31对动脉粥样硬化进程具有较好的减轻效果。

总之，靶向多肽SS-31对ApoE敲除大鼠动脉粥样硬化具有较好的治疗效果，分析其原因与该药能够缓解大鼠氧化应激反应有关。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

汪洁、党晶艺：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；任何：进行统计学分析;张东伟、郝启萌：提出研究思路，分析试验数据，论文审核