特发性膜性肾病肾组织中足细胞数目减少与α3β1整合素关系

雷静，苏晓晓，张蓓茹，何平，周华

无明显诱因的膜性肾病称为特发性膜性肾病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)，其是肾病综合征和原发性肾小球疾病的常见原因。近年来IMN在原发性肾小球疾病中的构成比明显增多[1]。IMN是一种非炎性自身免疫性肾病，其病理特征为存在上皮下免疫复合物，通过光学显微镜观察到肾小球基底膜弥漫性增厚，以及通过免疫荧光发现沿着肾小球毛细血管环周边的IgG和补体颗粒沉积。IMN的病因为上皮下原位免疫复合物沉积，C5b-9形成，插入足细胞中。足细胞通过合成肾小球基底膜(GBM)的组成部分、狭缝隔膜，参与保持内皮细胞的稳定性来维持肾小球滤过率及GBM的完整性[2]。而足细胞凋亡是IMN进展中的关键步骤。整合素是肾小球滤过膜与足细胞的主要黏附分子，在调控细胞生存中起到重要作用，狭缝隔膜是限制蛋白质滤过最重要的屏障，而ɑ3β1整合素是连接足细胞和狭缝隔膜的重要组成成分，也是维持足细胞抵抗滤过压力的重要组成部分。目前对于整合素介导的足细胞生存在许多疾病中均有研究[3-4]，但对于整合素与特发性膜性肾病中足细胞的关系鲜见报道。本研究探讨IMN中足细胞的减少与整合素ɑ3β1的关系，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)肾组织: 采集2016年2月—2017年3月中国医科大学附属盛京医院肾内科经临床和肾活检确诊的IMN住院患者30例的活检肾组织石蜡切片(病例组)，排除糖尿病、肿瘤、系统性红斑狼疮等疾病引起的膜性肾病。其中男19例，女11例； 年龄28～66岁，中位数48.7岁。 同期于本院泌尿外科行肾脏肿瘤手术患者30例，采取远离肿瘤的正常区域肾组织(对照组)，制作石蜡切片，其中男23例，女7例；年龄31～72岁，中位数54.5岁。(2)试剂：肾母细胞瘤抑制基因1(Wilms' tumor suppressor gene，WT1)兔抗人单克隆抗体(北京中杉金桥公司)；整合素ɑ3、整合素β1兔抗多克隆抗体(abcam公司)；免疫组化试剂盒，DAB显色试剂(北京中杉金桥公司)。(3)仪器： Nis-Elements F 3.0(日本)图像采集软件、图像分析软件； Nikon E 800(日本)显微镜。

1.2 观测指标与方法

1.2.1 肾小球足细胞WT1表达检测： WT1抗原在肾小球足细胞核表达，在其余肾组织中不表达，因此可用来评估肾小球足细胞数量。采用免疫组化方法对足细胞进行特异性染色。对2种肾组织石蜡切片脱蜡至水，于柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液中进行微波抗原修复7.5 min，室温自然冷却，磷酸盐缓冲液(PBS)洗片，滴加3% H2O2室温孵育40 min，PBS洗片，正常羊血清室温封闭40 min，PBS洗片，滴加抗WT1单克隆抗体，4 ℃孵育过夜，次日室温复温20 min，PBS洗片，滴加二抗，室温孵育25 min，PBS洗片，滴加辣根酶标记链霉素卵白素工作液20 min，PBS洗片，DAB显色，苏木素复染，流水返蓝，脱水透明后用中性树脂封片、观察，细胞核染色为棕褐色者为足细胞。以PBS取代一抗作为阴性对照。

1.2.2 肾小球足细胞相对密度计算：按如下公式计算，Dpodo =Npodo/GRoi ×△S ×106(Cells/μm2)[13],Npodo为每个肾小球足细胞绝对数目，GRoi 为Nis-Elements Br-3.0分析软件所选感兴趣区域的面积，即肾小球的相对面积。于400倍显微镜下测量图像的长和宽，计算出图像框的实际面积A(μm2)，Nis-Elements Br-3.0分析软件的“免疫组化自动分析模块”测量图像框的统计框总面积R(μm2)。△S =A/R，经计算400倍图像△S =0.006 729 μm2。

1.2.3 肾小球足细胞ɑ3β1整合素表达检测：采用免疫组化方法检测。通过Nis-Elements Br-3.0软件分析ɑ3β1整合素表达的平均光密度值并进行免疫组化半定量分析。具体步骤除每张切片滴加α3多克隆抗体(浓度1∶1 500)或β1多克隆抗体(浓度1∶1 500)外，其他同WT1表达检测。

2 结 果

2.1 2组足细胞绝对数目及相对密度比较 病例组患者单位肾小球足细胞绝对数目(Npodo)及相对密度(Nv)均低于对照组(P均<0.05)，见表1、图1。

2.2 2组肾小球ɑ3β1整合素表达比较 病例组肾小球ɑ3β1整合素表达的平均光密度值(2 795.33±3 999.97)较对照组(7 031.94±8 702.80)降低(t/P=2.423/0.020)，见图2。

表1 2 组肾组织足细胞数目及密度比较

图1 WT1 标记足细胞核的肾小球病理表现

图2 肾小球ɑ3β1整合素表达变化

2.3 足细胞与ɑ3β1整合素及肾功能相关性分析 Pearson相关分析显示，足细胞绝对数和相对密度分别与ɑ3β1整合素呈正相关,即随着整合素表达升高，足细胞绝对数目、相对密度均升高，与24 h尿蛋白呈负相关，即随IMN患者足细胞绝对数和相对密度降低，24 h尿蛋白升高；足细胞绝对数和相对密度与肌酐、白蛋白未见显著相关(P>0.05)，见表2。

表2 IMN患者足细胞数量与ɑ3β1整合素及肾功能相关性

3 讨 论

膜性肾病是成人肾病综合征肾活检诊断中最常见的疾病类型，如果未经治疗，约1/3可自发缓解，特别是抗PLA2R水平不足或较低的患者，10年内进展终末期肾病(ESRD)的患者约占1/3，其余患者发展为非进展性慢性肾病(CKD)，因此对诊断为膜性肾病的患者进行积极干预治疗非常重要。在IMN中[5]，沉积物处于上皮下位置，直接与足细胞的足突相邻，免疫介导的疾病可损伤足细胞，而足细胞减少也是IMN进展的关键。足细胞作为构成滤过膜的重要组成成分，其数目减少可导致肾小球滤过膜损伤，反过来也加速了足细胞的丢失，导致IMN的进展。

本实验通过用WT1标记足细胞核来检测病例组与对照组肾组织切片的足细胞绝对数目，计算其相对密度，结果显示，病例组足细胞绝对数目、相对密度均较对照组降低。尚瑜等[6]分析了36例MN患者，发现肾组织中足细胞数目明显减少，与此实验结果一致。且尚瑜等[7]通过测量IMN患者尿中足细胞数，结果显示，Ⅱ期和Ⅲ期膜性肾病患者尿足细胞数较Ⅰ期膜性肾病患者明显减少,表明足细胞在发病初期从尿中丢失最为明显。足细胞是一种特异性的终末分化细胞，是不可再生细胞。导致足细胞凋亡的可能因素有：(1)细胞的应激状态，如氧化应激和内质网应激，促使RAAS系统所致的足细胞损伤[8]，其中醛固酮可通过钙皮质激素受体(MR)来介导足细胞损伤[9]，同时醛固酮还增加C末端Src激酶(Csk)的表达，诱导足细胞凋亡[10]。(2)若患者合并高血糖，也可通过诱导活性氧产生而引起足细胞凋亡[11]。(3)内质网中积累的未折叠蛋白导致的细胞压力称为内质网应激，而长期或持续的内质网应激可能具有细胞毒性，导致足细胞凋亡[9]。(4)各种细胞因子也参与足细胞的凋亡， 转化生长因子-β1在足细胞中可诱导特定的信号通路，参与足细胞的存活和凋亡平衡[12]。肿瘤坏死因子-α被认为参与足细胞凋亡，但其机制尚不完全清楚[13]。

蛋白尿的产生与肾小球滤过屏障密切相关，滤过屏障主要由毛细血管内皮细胞、基底膜及足细胞构成，肾小球毛细血管内皮细胞属于有孔内皮细胞，其窗孔只有一层带负电荷酸性糖蛋白组成的细胞衣覆盖，可阻止白蛋白等大分子通过。足细胞的突起相互交织，在这些足突之间覆有一层裂孔隔膜。而且，足细胞足突中的细胞骨架与细胞内的相关蛋白相互作用，维持滤过屏障的完整性。本实验验证了IMN患者足细胞与白蛋白、肌酐及24 h尿蛋白的关系，结果表明，足细胞绝对数目、相对密度与白蛋白无明显相关性，这可能与IMN患者滤过屏障破坏使得白蛋白丢失过多有关，而测量的足细胞数是肾穿刺时肾组织仅存的足细胞。且足细胞绝对数目、相对密度与肌酐无明显相关性，但随着肾组织中足细胞绝对数目与相对密度的降低，尿蛋白逐渐增多。既往有研究表明[7]，IMN患者尿中足细胞数与24 h尿蛋白呈负相关。目前研究认为，足细胞足突中的肌动蛋白细胞骨架结构改变，继而发生隔膜蛋白改变出现蛋白尿[14]，随着蛋白尿的进一步加重，又反过来继续损害足细胞，造成滤过屏障进一步破坏。因此，足细胞损伤或耗竭在蛋白尿的发生中起关键作用。

整合素是异质二聚体的穿膜蛋白，由ɑ和β亚基组成，它们是细胞与细胞外基质黏附的受体。足细胞主要经ɑ3β1整合素锚定在GBM上。在本研究中，病例组整合素的总表达量明显低于对照组。ɑ3β1整合素对维持滤过屏障结构完整性有重要作用。ɑ3β1介导足细胞黏附于GBM的Ⅳ型胶原、层黏连蛋白和纤维连接蛋白上，其表达改变会使足细胞与GBM的黏附性下降，导致足细胞脱落。敲除ɑ3基因，动物在出生时死亡，发现其肾小球中足细胞完全脱落，而敲除β1后，动物出生后出现大量蛋白尿，同时发现足细胞丢失。而其中涉及机制可能为，ɑ3β1通过下调 Bax/Bcl-2、蛋白激酶C通路阻止足细胞凋亡和脱落[15]。

因此，肾组织切片中足细胞绝对数目及相对密度可用于辅助评价IMN患者病情严重程度。同时，也应该同时监测尿液中足细胞数目的变化，进一步证实足细胞在膜性肾病进展中的作用。目前对于IMN患者肾组织中足细胞与整合素、PLA2抗体等研究及足细胞与患者的临床、病理指标等研究较少，还需大量的循证医学证据深入探究足细胞在膜性肾病中的作用。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

雷静：实施研究过程，数据收集，分析整理，设计论文框架，撰写论文；苏晓晓：进行文献调研与整理；张蓓茹：协助修订论文；何平：研究选题，设计研究方案、研究流程，修订论文，论文终审；周华：提出研究方向