瑞舒伐他汀经PPARγ-LXRα信号通路抑制THP-1巨噬细胞脂质蓄积的实验研究

孙定军，邢波，陈漠水，马添翼，张福伟

动脉粥样硬化是心血管疾病的病理基础，心血管疾病是人类死亡的主要原因。动脉壁中胆固醇积聚是动脉粥样硬化的特征，其中巨噬细胞起决定性作用[1-2]。巨噬细胞形成的泡沫细胞在脂质积累中起着至关重要的作用。ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)可促进胆固醇流出至无脂质载脂蛋白A1并增加高密度脂蛋白(HDL)的形成，是预防动脉粥样硬化的重要靶点[3-4]。ABCA1基因在巨噬细胞中的表达受配体依赖性核受体的转导调节。过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)通过诱导肝脏X受体α(liver X receptor α，LXRα)基因和ABCA1基因的转录来增强胆汁外流[5-7]。LXRα与类视黄醇X受体结合形成异二聚体，并跟踪ABCA1启动子中特定DNA反应元件的连接，刺激ABCA1基因转录，增加ABCA1依赖性胆固醇外流至ApoA1。因此，PPARγ/LXRα/ABCA1信号可刺激巨噬细胞胆固醇外流[8]。瑞舒伐他汀是一种选择性HMG-CoA还原酶抑制剂。HMG-CoA还原酶抑制剂是转变3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A为甲戊酸盐—胆固醇前体的限速酶。瑞舒伐他汀的主要作用部位是肝，是降低胆固醇的靶向器官[9]。瑞舒伐他汀增加了肝LDL细胞表面受体数目，促进LDL的吸收和分解代谢，抑制了VLDL的肝合成，由此降低VLDL和LDL微粒的总数[10]。本研究拟探讨瑞舒伐他汀经PPARγ-LXRα信号通路抑制THP-1巨噬细胞脂质蓄积的机制，为动脉粥样硬化的治疗提供理论依据，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)THP-1巨噬细胞：购自中国科学院细胞库；(2)试药试剂：瑞舒伐他汀(美国sigma公司)、NaHCO3、青霉素、链霉素、RPMI1640培养基(赛默飞世公司)，10%热灭活的胎牛血清(FBS，sigma公司)、氧化修饰低密度脂蛋白(ox-LDL)(碧云天生物科技公司)、MTT(碧云天生物科技公司)、十二烷基硫酸钠(赛默飞世公司)、膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)试剂(BD Pharmingen公司)、MMLV逆转录酶(Gibco/BRL公司)、6%SDS-聚丙烯酰胺电泳凝胶(Millipore Corporation，USA)、PVDF(Millipore Corporation，USA公司)、PPARγ-LXRα一抗(均为1∶1 000，美国赛默飞世公司)，总胆固醇(TC)，游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)试剂盒为贝克曼原厂试剂、RNAzol试剂盒(sigma公司)；(3)仪器设备：UK-098CO2培养箱(美国热电)、VT-098酶标仪(美国BioTek Instruments)、FC500流式细胞仪(Beckman Coulter)、贝克曼AU-480生化仪、Light Cycler Run 5.32实时PCR系统(美国Roche)。

1.2 THP-1巨噬细胞培养及分组 2018年12月—2019年3月于海口市人民医院/中南大学湘雅医学院附属海口医院中心实验室进行实验，将THP-1巨噬细胞在含有10%FBS、0.37%NaHCO3、青霉素(100 U/ml)、链霉素(100 U/ml)的RPMI1640培养基置于5%CO2的湿润培养箱中。每2 d更换一次培养基。对照组：取THP-1巨噬细胞液(细胞浓度为5×106/ml)10 ml于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于CO2培养箱(37℃、5%CO2、20% O2)；ox-LDL组：取THP-1巨噬细胞液(细胞浓度为5×106/ml)10 ml于10%胎牛血清的DMEM培养液中，加入ox-LDL，使其终浓度为100 mmol/L，置于CO2培养箱(37℃、5%CO2、20% O2)；瑞舒伐他汀低、中、高剂量组：取THP-1巨噬细胞液(细胞浓度为5×106/ml)10 ml于10%胎牛血清的DMEM培养液中，加入ox-LDL，使其终浓度为100 mmol/L，各组分别加入瑞舒伐他汀，使瑞舒伐他汀最终浓度为10.0 μg/ml、100.0 μg/ml、1 000.0 μg/ml，置于CO2培养箱(37℃、5% CO2、2%O2、93%N2)。以上各组每孔设6个复孔，培养72 h。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 THP-1巨噬细胞活力测定：细胞培养结束后，向每个孔中加入MTT(0.5 mg/ml)溶液100 μl， 然后将96孔板在37℃、5%CO2、饱和湿度下温育，加入20%十二烷基硫酸钠(含有50%二甲基甲酰胺)100 μl以溶解甲晶体，在酶标仪570 nm波长下测量光密度值(OD值)。

1.3.2 THP-1巨噬细胞凋亡水平测定：使用FITC缀合的膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)双重染色，通过流式细胞术测定细胞凋亡。与番茄红素一起温育后，将细胞在PBS中洗涤2次，通过胰蛋白酶消化收获，悬浮于PBS液3 ml中，并以3000×g离心5 min。除去上清液后，将细胞在含有膜联蛋白V-FITC和PI的结合缓冲液中室温温育15 min。 使用流式细胞仪进行荧光分析。

1.3.3 THP-1巨噬细胞TC、FC、CE水平测定：应用贝克曼AU-480型生化仪测定细胞上清液TC、FC和CE的水平。

1.3.4 THP-1巨噬细胞PPARγ-LXRα基因水平测定：通过RNAzol试剂盒从细胞培养物中分离总细胞RNA，并使用oligo(dT)作为引物逆转录成cDNA(MMLV逆转录酶，Gibco/BRL，698547)，然后用PPARγ、LXRα、ABCA1，ApoA1和β-肌动蛋白上的10个引物碱基扩增。用于扩增PPARγcDNA的引物是位于5'-非翻译区的5'-TCTCCAGCATTTCTACTCCAC-3'和位于3'-非翻译区的5'-GCCAACAGCTTCTCCTTCTCG-3'，用于扩增LXRαcDNA的引物是5'-TCAGCCGGGAGGACCAGATTG-3'和5'-CCGGAGGCTCACCAGTTTCATTAG-3'，用于扩增β-肌动蛋白的引物是5'-GAGCGGGAAATCGTGCGTGAC-3'和5'-GCCTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3'。使用Light Cycler Run 5.32实时PCR系统进行定量PCR，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s(35个循环)，然后在72℃持续7 min。PPARγ、LXRα和β-肌动蛋白扩增产物大小分别为460、404、439、215和518 bp。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙锭染色。通过Matrox Inspector 2.1软件定量PPARγ、LXRα相对水平。

1.3.5 THP-1巨噬细胞PPARγ-LXRα蛋白水平测定：从THP-1巨噬细胞中提取总蛋白质，并与上样缓冲液混合,使用6%SDS-聚丙烯酰胺电泳凝胶，在每个泳道(20 μg)中加载等量蛋白质电泳120 min(80 V、30 min和120 V、90 min)。将相关蛋白质在200 mA下转移至PVDF膜2 h，然后用5%脱脂奶粉封闭并与PPARγ-LXRα抗体一起在4℃温度下孵育过夜;然后将膜用PBS洗涤3次(每次10 min)，然后与HRP缀合的第二抗体一起温育2 h。用BeyoECL Plus(Beyotime)和Tanon 5500观察Western印迹条带。

2 结 果

2.1 各组THP-1巨噬细胞的OD值、存活率比较 与对照组比较，ox-LDL组OD值、存活率均明显升高(P<0.05)，与ox-LDL组比较，瑞舒伐他汀各剂量组OD值、存活率明显降低(P均<0.05)，且随着瑞舒伐他汀剂量的增加，各组OD值、存活率逐渐降低(P均<0.05)，见表1、图1。

表1 各组THP-1巨噬细胞OD值、存活率比较

图1 各组THP-1巨噬细胞增殖情况(甲基紫染色,×200)

2.2 各组THP-1巨噬细胞凋亡率比较 与对照组THP-1巨噬细胞凋亡率(12.2±0.19)%比较，ox-LDL组(1.13±0.24)%降低(t/P=12.547/0.000)，与ox-LDL组比较，瑞舒伐他汀低(3.38±0.20)%、中(7.11±0.21)%、高(7.69±0.18)%剂量组凋亡率水平依次升高(F/P=19.632/0.000)，见图2。

2.3 各组THP-1巨噬细胞TC、FC、CE水平比较 与对照组比较， ox-LDL组TC、FC、CE水平明显升高(P均<0.05)；与ox-LDL组比较，瑞舒伐他汀各剂量组随着瑞舒伐他汀剂量的增加TC、FC、CE水平逐渐降低(P<0.05)，见表2。

2.4 各组THP-1巨噬细胞PPARγ、LXRα mRNA表达水平比较 与对照组比较， ox-LDL组PPARγ、LXRα mRNA表达水平明显降低(P<0.05)；与ox-LDL组比较，瑞舒伐他汀各剂量组随着瑞舒伐他汀剂量的增加PPARγ、LXRα mRNA水平逐渐升高(P<0.05)。见表3。

表3 各组THP-1巨噬细胞PPARγ、LXRα mRNA表达水平比较

2.5 各组THP-1巨噬细胞 PPARγ、LXRα蛋白表达水平比较 与对照组比较， ox-LDL组PPARγ、LXRα 蛋白表达水平均降低(P<0.05)；与ox-LDL组比较，瑞舒伐他汀各剂量组随着瑞舒伐他汀剂量的增加PPARγ、LXRα蛋白表达水平逐渐升高(P<0.05)。见表4、图3。

图2 各组THP-1巨噬细胞凋亡情况

表2 各组THP-1巨噬细胞TC、FC、CE水平比较

组 别复孔数TCFCCE对照组6158.63±15.63120.36±19.63153.63±19.52ox-LDL组6569.63±17.25561.69±20.36526.25±18.25瑞舒伐他汀低剂量组6445.63±14.58469.32±16.58419.52±21.63瑞舒伐他汀中剂量组6334.63±13.98321.69±19.63352.36±18.63瑞舒伐他汀高剂量组6221.63±14.42186.36±18.54296.59±19.63 F值121.321259.658368.487 P值0.0000.0000.000

表4 各组THP-1 巨噬细胞PPARγ、LXRα蛋白表达水平比较

图3各组THP-1巨噬细胞PPARγ、LXRα蛋白表达水平比较

3 讨 论

本研究结果显示，与ox-LDL组比较，瑞舒伐他汀各剂量组OD值、存活率、TC、FC、CE水平均明显降低，凋亡率明显升高，提示瑞舒伐他汀能抑制THP-1巨噬细胞增殖，促进THP-1巨噬细胞凋亡，促进THP-1巨噬细胞胆固醇流出抑制泡沫细胞的形成。瑞舒伐他汀在多种疾病中具有多种生物学功能，如心血管疾病和糖尿病肾病，其具有预防脂质积聚，降低血压，发挥抗动脉粥样硬化作用。研究表明，瑞舒伐他汀通过降低TC、LDL-C、TG和增加HDL-C的水平起到抗动脉粥样硬化作用[11]。瑞舒伐他汀可抑制巨噬细胞活化和泡沫细胞形成，还可以保护HUVEC免于细胞凋亡，并提示通过保护免受H2O2介导的氧化应激机制进行保护[12-14]。此外，瑞舒伐他汀降低胆固醇水平并抑制由脂多糖(LPS)诱导的巨噬细胞因子产生，并改变喂食高脂肪酸饮食的小鼠或大鼠中脂肪酸的组成[15-17]。瑞舒伐他汀可通过延迟LDL氧化保护血管内皮细胞，通过抑制血小板聚集防止血液凝固，增加HDL-C并降低TC、TG和LDL水平。动物实验还显示，瑞舒伐他汀可降低LDLR -/-和ApoE -/-小鼠的动脉粥样硬化斑块面积，并显著降低小鼠胆固醇水平，然而，所涉及的分子机制尚不清楚[18-19]。随后的研究表明，瑞舒伐他汀可以调节NF-κB信号通路，并抑制白细胞介素-6和肿瘤坏死因子-α的表达。炎性反应和胆固醇代谢紊乱被认为是引起动脉粥样硬化的主要危险因素，而瑞舒伐他汀可潜在地用作抗动脉粥样硬化。

PPARγ/LXRα途径是调节ABCA1表达的核心机制，该途径对ABCA1表达的影响已被广泛接受。LXRα作为核转录因子，可以调节胆固醇转运途径中的多个基因，例如ABCA1和ABCG1的转录调节[20]。另一项研究表明，LXRα兴奋剂T0901317可抑制小鼠动脉粥样硬化的进展。细胞实验证实，T0901317通过激活巨噬细胞中的LXRα上调ABCA1和ABCG1的表达，从而驱使细胞内的胆固醇流向ApoA1和HDL并抑制泡沫细胞的形成。另一项研究表明，LXRα表达受其他核转录因子调节，如PPAR。 PPAR是一种核转录因子，具有3种亚型：PPARα、PPARβ和PPARγ[21]。这些核转录因子与其配体组合可改变空间构象，随后与靶基因启动子内的PPAR反应元件结合以调节靶基因的转录[22]。这些核转录因子也可以激活LXRα并与AX受体结合形成异二聚体，其调节靶基因的转录。在3种PPAR亚型中，PPARγ可调节葡萄糖和脂质代谢，以及炎性反应和免疫作用[23]。因此，这些转录因子是细胞分化和脂质代谢转录调节的关键。本研究结果显示，与ox-LDL组比较，瑞舒伐他汀各剂量组PPARγ、LXRα mRNA和蛋白表达明显升高，这与上述讨论一致，同时提示，瑞舒伐他汀促进PPARγ、LXRα mRNA、蛋白表达，进而介导PPARγ/LXRα途径，促进胆固醇流出，并减少THP-1泡沫细胞中的脂质积累。已经证实PPARγ上调LXRα表达。研究表明，瑞舒伐他汀在高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)中表达PPARγ，并且还激活腺苷5'-一磷酸(AMP)介导的蛋白激酶(AMPK)信号通路。这些研究也与本结果一致。

综上所述，瑞舒伐他汀能促进THP-1巨噬细胞胆固醇流出，减少THP-1泡沫细胞中的脂质积累；其机制与瑞舒伐他汀促进PPARγ、LXRα mRNA、蛋白表达，进而激活PPARγ/LXRα途径有关。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

孙定军：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写及修改；邢波、陈漠水：参与实验过程并进行数据分析，论文审核；马添翼：细胞培养及相关实验；张福伟：细胞培养及相关实验检查。