QuEChERS超高效液相色谱-串联质谱法检测中药饮片中黄曲霉毒素

2020-06-17孙夏荣葛晓明王建花

中国药业 2020年11期

孙夏荣，葛晓明，王建花

（江苏省南京市食品药品监督检验院，江苏南京 211198）

黄曲霉毒素（aflatoxins）是由黄曲霉和寄生曲霉中某些产菌毒株产生的双呋喃环类毒素，是迄今发现的毒性最大的真菌毒素，常见有 B1，B2，G1，G24 种，其中以黄曲霉毒素B1的毒性最大、致癌性最强，其毒性相当于氰化钾的10倍、砒霜的68倍，已被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构（IARC）划定为Ⅰ类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质[1-4]。中药材及其制剂在储存过程中常会发生霉变，产生很多对人体有害的真菌毒素[5-6]，2015年版《中国药典(一部)》已规定了部分中药材品种黄曲霉毒素B1的限量不得超过5 μg／kg、黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的总量不得超过 10 μg ／kg[7]。

目前，文献报道的黄曲霉毒素检测方法主要有薄层色谱（TLC）法[8]、酶联免疫（ELISA）法[9]、高效液相色谱（HPLC）法[10-11]、液相色谱 - 串联质谱（LC-MS ／MS）法[12-13]等。样品的前处理方面，现行《中国药典》执行的标准为免疫亲和柱净化法联用色谱技术，由于免疫亲和柱填料大多采用进口填料，单根免疫亲和柱售价约为100元，若长期使用则相关检测成本较高。LC-MS／MS法专属性好、灵敏度高、抗干扰强，能有效排除假阳性的干扰，适合在复杂基质下同时筛查痕量的多种黄曲霉毒素。

QuEChERS（quick，easy， cheap，effective， rugged，safe）是由美国农业部的化学家ANASTASSIADAS等于2003年提出的一种快速样品前处理技术[14-15]，用于农药残留的检测。该方法具有分析快速、回收率高、精确度和准确度好、使用溶剂量少、污染少、操作简便等优点，近年来主要用于农产品和食品的各项检测中，但在药品的检测中应用较少。本研究中采用基于QuEChERS原理的样品前处理的快速提取方法，结合超高效液相色谱(UPLC)-MS／MS法，建立中药饮片中4种黄曲霉毒素（AFB1，AFB2，AFG1，AFG2）的检测方法，提供一种不使用免疫亲和柱的黄曲霉毒素的检测思路，为药品的监管提供有效的技术支撑。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 6470型三重四极杆串联质谱联用仪，包括电喷雾离子化源（ESI）、MassHunter数据处理系统（美国安捷伦公司）；CPA225D型电子天平（德国Sartorius公司，精度为十万分之一）；涡旋混匀器（德国维根公司）；X-30R型冷冻离心机（德国 Beckman公司）；Milli-Q型超纯水系统（美国默克公司）；N-EVAP 24型氮吹仪（美国 Organomation公司）；KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为250 W，频率为 30 kHz）。

1.2 试药

甲醇、乙腈（色谱纯，Honeywell公司）；甲酸、乙酸铵（色谱纯，Aladdin公司）；无水硫酸镁（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；氯化钠（分析纯，南京化学试剂股份有限公司）；水为超纯水；黄曲霉毒素混合对照品（批号为 610001-201804）， AFB1，AFB2，AFG1，AFG2含量分别为 0.93，0.30，0.93，0.35 μg ／mL，均购自中国食品药品检定研究院；陈皮、大枣、柏子仁均为市售样品或抽样样品。

2 方法与结果

2.1 液相色谱及质谱条件

2.1.1 液相色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB C18RRHD柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相：2 mmoL ／L 乙酸铵溶液（含0.1%甲酸，流动相A）-乙腈（流动相B），按表1进行梯度洗脱；流速：0.3 mL ／min；柱温：30 ℃；进样量：2 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.1.2 质谱条件

离子源模式(ESI)：正离子模式；毛细管电压4 000；雾化器流速：9 L／min；干燥器温度：325℃；雾化器压力：40 psi（1 psi＝ 6.89 kPa）；鞘气温度：350 ℃ ；鞘气流量：11 L／min；扫描模式：动态多反应离子监测（DMRM）。相关质谱采集参数见表2。

2.2 溶液制备

分别精密量取黄曲霉毒素混合对照品1 mL，置20 mL容量瓶中，用70%甲醇溶液稀至刻度，摇匀，作为标准贮备液。精密量取标准贮备液适量，用70%甲醇溶液稀释成每 1 mL 含 AFB1，AFG10.093， 0.465，0.930， 1.860， 3.720， 9.300 ng， AFB20.030， 0.150，0.300， 0.600， 1.200， 3.00 ng， AFG20.035， 0.175，0.350，0.700，1.400，3.50 ng 的混合标准系列溶液。取供试品粉末 2 g（过3号筛），精密称定，置50 mL离心管中，加入 80%乙腈溶液（含 0.1%甲酸）20 mL，超声10 min，离心 5 min（离心速率 10 000 r／min），取上清液，再加入0.5 g氯化钠和2 g无水硫酸镁，充分涡旋振荡2 min，离心 5 min（离心速率 6 000 r／min），取上清液1 mL用50℃氮气吹干，快速加入2 mmoL／L乙酸铵溶液（含 0.1% 甲酸）-乙腈（65 ∶35，V／V）1 mL，过微孔滤膜（0.22 μm），取滤液，供 LC-MS ／MS 分析。

2.3 方法学考察

线性关系考察：取6个不同质量浓度的混合标准系列溶液，分别进样，记录峰面积。以质量浓度（X，ng／mL）为横坐标、峰面积为纵坐标（Y）绘制标准曲线。结果见表3。

精密度试验：取同一质量浓度的混合标准系列溶液（AFB1， AFG10.930 ng ／mL； AFB20.300 ng ／mL； AFG20.350 ng ／mL），进样 6 次。测定结果见表 3，各组分峰面积的 RSD均在 1.80% ～3.52%（n＝6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：精密称取空白样品2 g（过3号筛），共6份，加入标准贮备液0.1 mL，按供试品溶液制备方法制备，按拟订条件进样测定。结果见表3，上述各组分峰面积的 RSD＜4.00%（n＝6），表明方法重复性良好。

表2 黄曲霉毒素的质谱离子参数

稳定性试验：取重复性试验项下供试品溶液1份，置室温，分别于 0，4，8，12，24 h 时依法进样测定。结果见表 3，各组分峰面积的 RSD ＜5.00%（n＝5），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

检测限与定量限确定：将混合标准系列溶液加入空白样品溶液中，依法制备供试品溶液并进样测定。以信噪比（S／N）为 3∶1确定各组分的检测限（LOD），当 S／N为10∶1确定各组分的定量限（LOQ）。结果见表3。

准确度试验：取空白样品2 g，精密称定，共18份，每6份按低、中、高3种质量浓度水平分别精密加入标准贮备液 0.05，0.10，0.50 mL，依法制备供试品溶液并进样测定，计算回收率。结果见表3。

表3 黄曲霉毒素方法学考察结果（n＝6）

2.4 样品含量测定

对10批市售样品进行测定，结果在2批样品中检出AFB1，其余均未检出。详见图1和图2。

3 讨论

3.1 色谱条件优化

曾考察不同比例的甲醇-水系统、乙腈-水系统、乙酸铵-乙腈系统等多个流动相体系进行梯度洗脱。结果显示，在2 mmoL／L乙酸铵溶液的流动相体系下，各化合物的响应值最高、峰形较好，且加入一定量的甲酸可进一步提高各化合物的离子化效率，故选取2 mmoL／L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）-乙腈系统为流动相。

3.2 质谱条件优化

本试验中对影响离子化效率的干燥器温度、鞘气温度、鞘气流量、雾化器压力、毛细管电压、碰撞能量等条件均进行了优化，最终选择电喷雾正离子扫描模式，得各化合物最佳的质谱条件。

图1 黄曲霉毒素定性和定量离子对的DMRM图

3.3 样品前处理优化

提取溶剂选择：曾考察不同提取溶剂对4种黄曲霉毒素的提取效率，比较了甲醇、乙腈、不同比例的酸化甲醇水溶液（含0.1%甲酸）、不同比例的酸化乙腈水溶液（含0.1%甲酸），结果发现，不同类型的提取溶剂对黄曲霉毒素的提取效率存在差异。当提取溶剂为80%乙腈溶液（含0.1%甲酸）时，提取效率最高，各化合物回收率均超过85%，且选择高有机相比例的提取溶剂，可明显缩短氮吹时间，节约试验时间。因此，确定80%乙腈溶液（含0.1%甲酸）为提取溶剂。

提取方式选择：曾考察超声波提取、涡旋振荡提取2种方式对提取效率的影响，结果无显著性差异。从试验操作的方便性考虑，宜采用超声波提取。此外，进一步比较了不同超声时间（2，5，10，20，30 min）对提取结果的影响。结果显示，样品超声处理10 min和20 min与30 min相比，回收率无显著差异，故选择超声处理10 min。

盐析剂和复溶溶剂选择：QuEChERS方法中盐析剂对黄曲霉毒素的回收率也有一定影响。经比较发现，0.5 g氯化钠和2 g无水硫酸镁能促进提取液分层，回收效率最高。曾考察样品在氮吹蒸干后不同的复溶溶剂对试验的影响，比较甲醇、乙腈、2 mmoL／L乙酸铵溶液（含 0.1% 甲酸）-乙腈（65 ∶35，V／V）的复溶溶液，结果直接采用甲醇或乙腈作为复溶溶液，会出现溶剂效应。故最终选择2 mmoL／L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸）-乙腈（65∶35，V／V）作为复溶溶液，也作为流动相的初始比例溶液。