NOD1、SIRT1、IL-1β及MMP3与胎膜早破关系的研究

宋春红，杨蓉娟，甄娟△，吴莎，韩彦洁

胎膜早破（premature rupture of the membranes，PROM）严重影响母婴健康，其发病与感染、营养、社会经济因素密切相关，涉及炎症、凋亡、基因多态性等多种调控途径。虽经大量研究，PROM 的病因学及其发病机制仍不清楚，临床上对其预测和防治仍不理想。研究表明，宫内感染及绒毛膜羊膜炎是造成PROM 的最重要原因之一［1-2］。核苷酸结合寡聚化结构域受体（NOD）1 作为模式识别受体之一，可以识别细菌细胞壁肽聚糖及其裂解产物内消旋-二氨基庚二酸（iE-DAP），介导细菌引起的炎症反应［3］。沉默配型信息调节蛋白（SIRT）1属于SIRT家族，具有乙酰化酶活性，可发挥维持基因组稳定性、抗 氧化及抗炎作用［4］。目前对NOD1、SIRT1 在PROM中的作用研究较少。本研究通过检测胎膜早破患者胎膜组织NOD1、SIRT1表达及羊水基质金属蛋白酶（MMP）-3 与白细胞介素（IL）-1β 水平，分析各分子表达的相关性，以期从因子水平深入探讨PROM的发病机制，寻找新的预防及治疗途径。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2015年1月—2016年12月在本院产检并住院、以剖宫产结束分娩的单胎初产妇90例，分组情况如下：（1）足月胎膜早破（term premature rupture of the fetal membranes，tPROM）组30 例，年龄（29.3±2.7）岁，孕（38.9±1.1）周。（2）未足月胎膜早破（preterm premature rupture of the fetal membranes，pPROM）组30 例，年龄（26.2±4.0）岁，孕（35.0±1.0）周。（3）正常对照组（正常足月妊娠妇女）30 例，年龄（28.7±3.5）岁，孕（38.7±1.1）周。3组产妇无羊水过多、妊娠期高血压等并发症，无胎儿染色体异常。PROM的诊断标准参见乐杰等主编的第7版《妇产科学》。PROM组破膜至新生儿出生时间间隔＜12 h，剖宫产前均未临产、未使用抗生素预防感染。tPROM组羊水细菌培养阳性率26.7%，pPROM组细菌培养阳性率33.3%，2组比较差异无统计学意义（χ2=0.317，P＞0.05）。本试验经医学伦理委员会批准，采集标本均经过知情同意。

1.2 标本采集 孕妇行剖宫产手术时取羊水5 mL，离心后取上清液，-70 ℃冰箱保存。胎盘娩出后，于胎膜破口附近处取全层胎膜组织，一部分以灭菌生理盐水漂净后，放于冻存管中-70 ℃保存、备用；另一部分胎膜组织制作胎膜卷放于10%中性福尔马林溶液固定24 h。

1.3 主要试剂 兔抗人NOD1 多克隆一抗购自美国Santa Cruz公司，兔抗人SIRT1多克隆一抗购自美国Sigma公司，山羊抗兔二抗、免疫组化通用型SP 检测试剂盒购自上海基因科技有限公司，兔抗人β-actin 单克隆一抗及IL-1β、MMP3 ELISA检测试剂盒购自武汉博士德生物工程公司。

1.4 免疫组化染色检测胎膜组织中NOD1 及SIRT1 的表达部位 采用SP法。胎膜组织固定后，常规脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋、切片，严格按实验流程进行免疫组化操作。观察NOD1 及SIRT1 在胎膜组织中的表达部位。判读标准：阳性细胞表现为细胞膜/浆/核出现清晰的黄色、棕黄色或棕褐色，阴性细胞表现为染色与背景一致或无明显着色。

1.5 Western blot 检测胎膜组织NOD1 及SIRT1 蛋白表达水平 胎膜组织剪碎后，用RIPA 细胞裂解液法提取胎膜匀浆蛋白，测浓度后取60 μg 蛋白样本进行SDS-PAGE 电泳，用Bio-Rad 转移装置将蛋白转移至硝酸纤维素薄膜，结束后将薄膜放入5%脱脂奶粉封闭，NOD1 及SIRT1 一抗4 ℃过夜。第2 天洗膜后加入羊抗兔二抗，37 ℃孵育1 h，弃去二抗，洗涤，增强化学荧光发光法暗室曝光显影。对图像进行扫描，以各目的蛋白与β-actin的吸光度值比值作为各目的蛋白的相对表达量。

1.6 羊水IL-1β及MMP3水平检测 羊水中IL-1β及MMP3水平测定采用ELISA法，严格按照试剂盒说明书操作。

1.7 统计学方法 采用SPSS 15.0 软件进行分析，计量数据以±s表示，多组间数据比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法。采用直线相关分析分析两变量相关性。计数资料比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NOD1 及SIRT1 在胎膜组织中的表达部位 在胎膜组织，NOD1主要表达于羊膜上皮细胞、蜕膜细胞和绒毛膜滋养细胞细胞浆，PROM 组胎膜组织中NOD1 表达强度高于正常对照组，pPROM 组NOD1表达强度高于tPROM组。SIRT1主要表达于蜕膜细胞和绒毛膜滋养细胞细胞核及细胞浆，少量表达于羊膜上皮细胞核及细胞浆，PROM 组胎膜组织中SIRT1表达较正常对照组降低，见图1。

Fig.1 Expressions of NOD1 and SIRT1 in fetal membranes(DAB,×100)图1 NOD1及SIRT1在胎膜组织中的表达（DAB,×100）

2.2 各组胎膜组织中NOD1及SIRT1的表达水平比较 tPROM 组、pPROM 组胎膜组织中NOD1 相对表达水平较正常对照组升高（P＜0.05），pPROM 组NOD1 表达高于tPROM 组（P＜0.05）。tPROM 组、pPROM 组胎膜组织中SIRT1 相对表达水平较正常对照组降低（P＜0.05），tPROM组与pPROM组SIRT1表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），见图2、表1。

Fig.2 Expressions of NOD1 and SIRT1 in fetal membranes measured by Western blot assay图2 NOD1及SIRT1在胎膜组织中的蛋白表达水平

Tab.1 Expression levels of NOD1 and SIRT1 in fetal membranes measured by Western blot assay表1 各组胎膜组织中NOD1及SIRT1蛋白灰度值与β-actin比值（n=30，±s）

Tab.1 Expression levels of NOD1 and SIRT1 in fetal membranes measured by Western blot assay表1 各组胎膜组织中NOD1及SIRT1蛋白灰度值与β-actin比值（n=30，±s）

＊＊P＜0.01；a与正常对照组比较，b与tPROM组比较，P＜0.05

组别正常对照组tPROM组pPROM组F NOD1/β-actin 0.53±0.16 1.00±0.19a 1.10±0.17ab 92.747＊＊SIRT1/β-actin 0.95±0.20 0.57±0.15a 0.55±0.18a 48.849＊＊

2.3 各组羊水IL-1β、MMP3 水平比较 tPROM 组、pPROM 组羊水IL-1β、MMP3 水平较正常对照组显著升高（均P＜0.05），pPROM 组较tPROM 组表达水平升高（均P＜0.05），见表2。

Tab.2 The expression levels of IL-1β and MMP3 in amniotic fluid in three groups表2 各组羊水IL-1β及MMP3水平（n=30，±s）

Tab.2 The expression levels of IL-1β and MMP3 in amniotic fluid in three groups表2 各组羊水IL-1β及MMP3水平（n=30，±s）

＊＊P＜0.01；a与正常对照组比较，b与tPROM组比较，P＜0.05

组别正常对照组tPROM组pPROM组F IL-1β（ng/L）3.37±1.17 12.76±3.31a 17.69±4.98ab 128.178＊＊MMP3（μg/L）1.81±0.72 2.17±0.64a 2.75±0.69ab 18.426＊＊

2.4 NOD1、SIRT1 与IL-1β 及MMP3 水平的相关性分析 胎膜组织中NOD1 表达与羊水IL-1β、MMP3水平呈正相关（r分别为0.509、0.598，P＜0.01）；胎膜组织中SIRT1表达与羊水IL-1β、MMP3水平呈负相关（r分别为-0.408、-0.337，P＜0.01）。

3 讨论

感染与炎症在PROM发生中占主要原因且与其互为因果［5］。炎症可以导致炎性因子释放增加，前列腺素、MMP合成及激活，导致胎膜破裂、宫颈扩张从而发动分娩。NOD1激活可以促进炎性细胞因子释放，激活炎症反应，SIRT1 可以抑制炎症反应，目前对NOD1及SIRT1在PROM中的研究较少，本研究重点关注PROM 患者NOD1、SIRT1、IL-1β 与MMP3的表达及其相互关系。

MMP 对细胞外基质的降解在PROM 发生中发挥了关键作用。MMP3 是MMP 家族中重要一员，在宫颈、妊娠相关组织如胎盘、胎膜中表达，在分娩、PROM、细胞因子诱导等情况下，MMP3生成及激活，降解、破坏细胞外基质及基膜，并激活其他类型的MMP，促使胎膜张力减弱，促进PROM 的发生［6-7］。本研究结果显示，PROM 组羊水中MMP3 表达水平较正常对照组增高，促进了胎膜细胞外基质水解。

宫内感染发生后，可以导致炎症反应，炎性细胞因子如IL-1β及趋化因子释放。趋化因子促进子宫和胎膜白细胞募集，进一步导致炎性细胞因子（如IL-1β及IL-6）释放。IL-1β可以激活环氧合酶2、促进子宫前列腺素产生，促进MMP 表达增加，导致细胞外基质降解及PROM 的发生［8］。在巴西人群中，IL1β-31T（rs1143627）多态性位点与未足月PROM/早产家族史及分娩时间相关［9］。本研究显示，PROM组患者羊水中IL-1β 水平较正常对照组升高，与PROM发生相关。

NOD1 属于胞浆内核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族成员，可以识别细胞浆内病原相关分子模式和损伤相关分子模式，从而诱导免疫应答。NOD1可以识别革兰阴性细菌及一些革兰阳性细菌的细胞壁肽聚糖及其裂解产物iE-DAP，激活受体相互作用丝氨酸苏氨酸蛋白激酶2，通过系列信号转导途径，最终激活核因子（NF）-κB，使其转位至细胞核内，促使靶基因转录，如编码IL-6、IL-1β 和肿瘤坏死因子（TNF）-α 基因［10］；亦可激活丝裂原活化蛋白激酶类分子途径，促进促炎分子如IL-1β、IL-6 及TNF-α的表达，从而激活免疫应答［11-12］。NOD1存在于胎盘滋养细胞中，在足月胎盘滋养细胞，NOD1被iE-DAP 激活后，可以导致IL-6 及单核细胞趋化蛋白1 等分泌；给予C57BL/6J 孕小鼠模型大剂量iEDAP 可在20 h 内导致小鼠早产；低剂量iE-DAP 虽不会导致早产但可以导致胎鼠体内产生众多细胞因子和趋化因子［13］。在体外培养羊膜细胞中，NOD1激活可以促进炎性细胞因子如IL-1β 和IL-6 的释放［14］。本研究证实，NOD1 表达于胎膜组织，且在PROM组胎膜组织中NOD1表达较正常对照组升高，与羊水IL-1β及MMP3表达呈正相关，表明NOD1作为上游信号因子，可能通过直接或间接作用促进炎性细胞因子及MMP3表达，参与胎膜破裂的发生。

人SIRT1基因位于染色体10q 21.3区域，具有一个高度保守的氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依赖的核心区域。SIRT1 兼具组蛋白及非组蛋白乙酰化酶活性，其主要功能有维持基因组稳定、抗氧化、维持端粒的结构与功能、调控糖和脂肪代谢、调控炎症反应等。在PROM患者中，感染和炎症导致细胞因子、前列腺素内过氧化物合酶2 和前列腺素以及细胞外基质构建相关酶如MMP3 激活，导致子宫收缩及胎膜破裂。NF-κB与上述炎性因子的激活密切相关。SIRT1 可与NF-κB 的P65 亚基K310位点结合去乙酰化，从而降低NF-κB的转录活性，抑制靶基因的表达，发挥抗炎作用［15］。另外，在脐静脉内皮细胞，SIRT1 可以抑制固有免疫受体如NOD 样受体蛋白3 炎性小体激活、进而抑制Caspase-1 裂解 及IL-1β 分泌，从而抑制炎症反应［16］，而NOD 样受体蛋白3 表达升高在PROM 中发挥了重要作用［17］。SIRT1在人类妊娠组织中表达且发挥作用。SIRT1在妊娠期糖尿病患者胎盘组织中表达降低，与蛋白激酶B-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白协同，参与了妊娠期糖尿病患者巨大儿及体脂率异常的发生［18］。本研究结果表明，PROM 患者胎膜组织中，SIRT1 相比正常对照组表达降低，且与羊水IL-1β及MMP3表达呈负相关，可能机制为PROM胎膜组织中SIRT1 表达减少，对NF-κB 的转录调控作用抑制减弱，导致炎性因子表达升高。

综上，本研究显示，PROM 患者胎膜组织中NOD1表达升高、SIRT1表达水平降低，羊水中IL-1β及MMP3 水平升高，NOD1 与羊水IL-1β 及MMP3 表达呈正相关，SIRT1与羊水IL-1β表达呈负相关。由此推断，在PROM发生发展过程中，NOD1、促炎细胞因子、MMP3 信号转导通路分子表达水平升高及激活，而SIRT1 表达水平降低，对炎症抑制作用减弱。减少NOD1、IL-1β 及MMP3 表达或抑制上述分子活性、增强SIRT1 表达或活性可能为PROM 的预防和治疗提供新途径。