Reg Ⅳ在不同分子分型乳腺癌中的表达及意义

宋姗姗，聂艳红，张春芳，林海月，张强，陈昊△

乳腺癌作为一种高度异质性的恶性肿瘤，发病率逐年上升，现已跃居女性恶性肿瘤的首位［1］。2013年St Gallen乳腺癌会议国际共识［2］根据雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）、人表皮生长因子受体2（HER-2）及增殖细胞核抗原（Ki-67）的表达，将乳腺癌分为腺腔A 型（LA）、腺腔B 型（LB）、HER-2 过表达型（HER-2+）和三阴性乳腺癌（TNBC）4 种亚型。乳腺癌不同分子分型的个体化治疗已在临床广泛应用［3］，但TNBC 型对内分泌治疗、HER-2 靶向治疗均不敏感，对常规化疗也不敏感，是目前唯一未建立特异性靶向治疗的亚型，因此寻找特异性治疗靶点是TNBC 研究的热点［4］。再生胰岛衍生家族成员（regenerating islet-derived family member，Reg）Ⅳ是从炎症性肠病基因库中筛选出的一种新的Reg家族亚型［5］。其主要在近端胃肠道表达，且异常表达于炎症损伤及肿瘤组织中［6-7］，可诱导肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移及抗凋亡等［8-9］。研究发现结直肠癌中Reg Ⅳ与表皮生长因子受体（EGFR）表达呈正相关，推测Reg Ⅳ是EGFR/Akt/AP-1 通路的上游因子［10-12］。由于TNBC 中亦有EGFR 相关信号通路的激活［13-14］，笔者推测Reg Ⅳ可能在TNBC 中发挥作用。鉴于此，本研究采用免疫组化染色、实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）和生物数据库大数据分析Reg Ⅳ在乳腺癌和不同分子分型中的表达及意义，为乳腺癌的诊断、治疗和临床评估提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集徐州医科大学附属连云港第一人民医院2017 年1 月—2019 年5 月的手术切除标本。患者均为女性，手术前未进行放化疗，所有病例均由2位正高级病理医师证实。乳腺癌组织共140 例，其中LA 型30 例，LB 型50 例（HER 阴性亚型和阳性亚型各25 例），HER2+型30 例，TNBC型30 例；正常乳腺组织75 例（距癌组织＞5 cm）作为对照。每例标本分别收集2 份，1 份标本于甲醛固定行免疫组化染色，另1份用于qRT-PCR。

1.2 主要试剂 Trizol RNA提取试剂（美国Invitrogen公司）；逆转录试剂盒及扩增试剂盒（南京诺唯赞公司）。GAPDH内参引物（江苏凯基公司）；Reg Ⅳ引物上游：CTGCTCCTATTGCTGAGCTG，下游 : GGACTTGTGGTAA AACCATCCAG［生工生物工程（上海）股份有限公司］；Reg Ⅳ一抗（美国Proteintech 公司），ER、PR、HER-2、Ki-67、EGFR一抗（广州安必平公司）；过氧化物酶阻断剂、三合一抗原修复液、二抗、DAB显色液、PBS（美国DAKO公司）。

1.3 免疫组化染色检测Reg Ⅳ蛋白的表达及结果判读 采用EnVison 法。3.7%中性甲醛固定标本，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片，采用免疫组化自动染色仪行免疫组化染色。以结肠癌作为阳性对照，PBS 代替一抗作阴性对照。Reg Ⅳ主要表达于细胞膜和（或）细胞质，根据阳性细胞百分比与染色强度进行综合计分。（1）随机读取5～10 个高倍镜视野（×400）计数阳性细胞百分比，无阳性细胞为0 分，1%～25%为1分，26%～50%为2 分，51%～75%为3 分，76%～100%为4 分。（2）按照着色强弱计分：未着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。（3）阳性细胞百分比与染色强度评分的乘积进行综合判断：≤3分为阴性，＞3分为阳性。依据2012年美国临床肿瘤学会（ASCO）的标准判读ER、PR表达。依据2013 年ASCO/CAP 乳腺癌HER-2 检 测指南判读HER-2 表达，其中HER-2（2+）进一步行荧光原位杂交（FISH）检测；对于EGFR的判读，存在明显的胞膜染色即视为阳性；Ki-67表达以20%为界，＜20%为低表达，≥20%为高表达。

1.4 qRT-PCR检测Reg ⅣmRNA的表达 液氮研磨法提取总RNA，测其浓度及纯度后逆转录为cDNA 并于-20 ℃保存备用。qRT-PCR 条件：预变性95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，共40个循环；熔解曲线95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s。每个样本复孔3次，得到熔解曲线、标准曲线和样本的Ct值，取2-ΔΔCt值进行相对表达量的比较。

1.5 生物数据库分析Reg ⅣmRNA的表达与预后 Kaplan-Meier Plotter 公共数据库（http://kmplot.com/analysis）收录了10 461 个癌症样本信息，其中包含5 143 例乳腺癌患者生存资料和基因表达信息。本研究分析该数据库内3 951例乳腺癌患者Reg ⅣmRNA 的表达水平与患者无复发生存期（RFS）、总生存期（OS）、无远处复发生存期（DMFS）、复发后生存期（PPS）的关系。

1.6 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料表达以均数±标准差（±s）表示，2 组间均数比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法。计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验，生存分析利用Kaplan-Meier 中Log-rank模型。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Reg Ⅳ蛋白在不同分子分型乳腺癌中的表达 Reg Ⅳ主要位于细胞膜和（或）细胞质，呈棕黄色颗粒（图1）。正常乳腺组织中Reg Ⅳ阳性表达率为25.33%（19/75），乳腺癌中阳性表达率为49.29%（69/140），其中LA 型53.55%（16/30）、LB 型52%（26/50）、HER-2+型66.67%（20/30）、TNBC 型23.33%（7/30）。Reg Ⅳ蛋白在乳腺癌中的阳性表达率明显高于正常乳腺组织（χ2=11.589，P＜0.01），在非TNBC型（LA型、LB型及HER-2+型）乳腺癌中的阳性表达率明显高于TNBC型（56.36%vs.23.33%，χ2=10.289，P＜0.01）。

2.2 RegⅣmRNA 在不同分子分型乳腺癌中的表达 qRT-PCR 结果显示，正常乳腺组织中RegⅣmRNA 的表达水平为1.19±0.47，乳腺癌中表达水平为2.04±0.66，其中LA 型为2.14±0.49、LB 型为2.26±0.55、HER-2+型为2.36±0.53、TNBC 型为1.25±0.48。Reg ⅣmRNA在乳腺癌中的表达水平明显高于正常乳腺组织（t=9.891，P＜0.01），正常乳腺组、非TNBC组和TNBC 组的Reg ⅣmRNA 表达水平差异有统计学 意 义（F=117.100，P＜0.01），其 中 非TNBC 组（2.25±0.53）高于TNBC 组和正常乳腺组，正常乳腺组与TNBC组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 Reg Ⅳ与乳腺癌相关标志物及临床病理特征间的关系 ER+、PR+、HER-2+组中Reg ⅣmRNA表达水平明显高于各自阴性表达组（P＜0.01），但EGFR阳性组和阴性组及Ki-67高表达和低表达组比较差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。40岁以上患者中RegⅣmRNA的表达水平高于40岁及以下患者；在肿瘤直径≤2 cm、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期患者RegⅣmRNA水平分别高于直径＞2 cm组和Ⅲ～Ⅳ期组；而在淋巴结是否转移、不同组织学分级、不同侧别组中Reg ⅣmRNA的表达差异无统计学意义，见表2。

2.4 Kaplan-Meier Plotter 数据库中乳腺癌患者RegⅣmRNA 表达与预后的关系 Kaplan-Meier Plotter数据库显示乳腺癌患者Reg ⅣmRNA的表达与患者预后相关。Reg Ⅳ高表达患者RFS、OS、DMFS 和PPS较低表达者明显延长，预后较好，见图2。

Fig.1 Immunohistochemical staining of RegⅣin normal breast and breast cancer tissues(EnVision methord，×200)图1 Reg Ⅳ在正常乳腺组织和乳腺癌中的表达（EnVision法，×200）

3 讨论

尽管基于ER、PR和HER-2的个体化治疗降低了患者的病死率，但乳腺癌患病基数大，且发病率呈逐年升高趋势［15］。鉴于乳腺癌的分子分型对治疗及预后评估的重要参考价值［16］，笔者从分子分型角度探讨RegⅣ在乳腺癌中的表达及意义。不同于Oue等［17-18］的结果，本研究发现Reg Ⅳ在正常乳腺中的表达低于乳腺癌，可能是由于文献中的组织学类型不同（研究对象仅为少量乳腺印戒细胞癌的患者），或文献中样本量较小导致。在乳腺癌4种分子分型中，Reg Ⅳ在非TNBC型乳腺癌中的表达明显高于TNBC型，且正常乳腺组织与非TNBC型乳腺癌中差异明显，与TNBC型无明显差异，表明Reg Ⅳ可能与非TNBC型乳腺癌的发生发展有关。本研究结果亦表明，Reg Ⅳ与ER、PR、HER-2有关，这可能是Reg Ⅳ在不同分子分型中表达差异的根源。在卵巢癌的研究中亦发现，Reg Ⅳ可能参与肿瘤的形成，而卵巢癌的发生发展与雌激素、孕激素分泌异常有关［19-22］。笔者推测，Reg Ⅳ在肿瘤的发生发展中的作用可能和激素或激素受体有关。此外，有研究发现ER、PR阳性乳腺癌患者的预后一般较好［23］，对于HER-2+患者采取靶向治疗亦可获得较好的预后［24］。RegⅣ与分子分型、生物标志物的相关性可能为其诊断及治疗提供帮助。Reg Ⅳ与EGFR无关，这与在结直肠癌中的研究不同［10］，可能是由于组织特异性，或者实验误差，抑或Reg Ⅳ的表达是由多个通路共同调控的。

Tab.1 Correlation between the expression of Reg ⅣmRNA and related markers in breast cancer表1 乳腺癌相关标志物与Reg ⅣmRNA表达的关系（±s）

Tab.1 Correlation between the expression of Reg ⅣmRNA and related markers in breast cancer表1 乳腺癌相关标志物与Reg ⅣmRNA表达的关系（±s）

＊＊P＜0.01

相关标志物ER n Reg ⅣmRNA t+-80 60 2.21±0.52 1.81±0.75 3.581＊＊images/BZ_77_410_793_412_794.pngPR+-62 78 2.22±0.58 1.89±0.69 3.120＊＊HER-2+-55 85 2.38±0.53 1.81±0.64 5.457＊＊Ki-67＜20%≥20%EGFR 46 94 2.13±0.63 1.99±0.67 1.208+-54 86 1.92±0.66 2.11±0.66 1.631

Tab.2 Comparison of the expression of Reg ⅣmRNA between different clinical pathological features of breast cancer表2 乳腺癌不同临床病理特征间Reg ⅣmRNA表达水平的比较（±s）

Tab.2 Comparison of the expression of Reg ⅣmRNA between different clinical pathological features of breast cancer表2 乳腺癌不同临床病理特征间Reg ⅣmRNA表达水平的比较（±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a与年龄≤40岁比较，P＜0.05

临床病理特征年龄（岁）≤40 40～60＞60侧别n Reg ⅣmRNA F或t 17 82 41 1.67±0.68 2.08±0.65a 2.11±0.64a 3.103＊＊左右67 73 1.96±0.65 2.10±0.66 1.266肿瘤直径（cm）≤2＞2 TNM分期Ⅰ～ⅡⅢ～Ⅳ淋巴结转移阳性阴性组织学分级64 76 2.16±0.68 1.94±0.63 1.982＊110 30 2.10±0.66 1.81±0.60 2.179＊52 88 2.07±0.74 2.02±0.61 0.500 1 2 3 16 79 45 2.25±0.60 2.04±0.66 1.95±0.70 1.159

Fig.2 Prognostic significance of Reg ⅣmRNA expression in breast cancer图2 Reg Ⅳ表达与乳腺癌的预后关系

本研究发现，40岁以上组Reg Ⅳ的表达高于40岁以下组。Zhong等［25］研究发现，年轻患者更易复发，预后更差。亦有研究发现，年轻患者ER、PR 阳性率更低，更倾向于预后差的TNBC 型［26］。Diab 等［27］也认为随着年龄的增加，ER 表达逐渐增高。考虑Reg Ⅳ与ER、PR的关系，这可能解释了Reg Ⅳ在高龄患者中表达较高，是预后较好的指标。本研究还发现，Reg Ⅳ高表达于肿瘤直径更小、TNM 分期更低的患者中。Shui等［28］发现肿瘤直径小的患者不易发生腋窝淋巴结转移，预后较好。Kaplan-Meier Plotter 数据库分析发现Reg Ⅳ高表达与良好的生存结局相关。结合Reg Ⅳ与乳腺癌相关标志物、分子分型和临床病理特征的关系，笔者认为，乳腺癌患者Reg Ⅳ表达水平越高，提示患者的预后越好。