低表达抑癌环状RNA在胃癌诊断及预后中作用的Meta分析

刘云，张曼玲，彭洪娇，时昭红

胃癌是世界上严重的恶性肿瘤之一，在所有癌症中其发病率及死亡率分别为第5 和第3 位［1］。但是，胃癌发病率和死亡率在世界范围内的分布并不均匀［2］。所有胃癌病例中有一半以上发生在东亚、欧洲中东部和中南美洲，尤其在日本和中国有着较高的发病率。胃癌起病隐匿，往往发现时已经进入晚期，早期诊断及手术根治性切除可能性低，术后5年生存率不足25%［3］。尽管现在临床上糖类抗原（CA）199、癌胚抗原（CEA）［4］、CA724［5］等肿瘤标志物已被广泛使用，但是其特异度（SPE）及敏感度（SEN）均不理想，且无法预测预后［6］。目前急需一种新的分子生物标志物用于更好地诊断胃癌及判断预后。

环状RNA（circRNA）是一类特殊的内源性非编码RNA，主要通过两外显子的套索环化或内含子的配对环化2种方式形成［7］。近年来，随着高通量测序技术和实验技术的发展和完善，有关circRNA 的研究不断深入，发现其在肿瘤诊断及判断预后方面有应用前景［8］。多个研究表明，circRNA 可以作为miRNA 的分子海绵，起到调控基因表达，调控增殖、迁移、侵袭等多种生物学过程的作用［9-10］。同时研究还发现，circRNAs 在胃癌患者肿瘤组织和血清样本中表达失调，并与临床病理结果相关，提示circRNAs可能是胃癌进展中的生物标志物［11-13］。鉴于目前缺乏对circRNA 在胃癌诊疗中的系统评价，本研究通过系统回顾和荟萃分析来评估低表达抑癌circRNA 与胃癌诊断及预后之间联系，旨在阐明circRNA 作为诊断胃癌生物标志物及判断预后的可能性，为临床决策提供帮助。

1 资料与方法

1.1 检索策略 对PubMed、Embase、Web of Science 数据库进行检索，检索2019年6月之前发表的文献。检索策略采用主题词与自由词相结合的方式，检索式为：“circRNA”或“circular RNA”且“stomach neoplasm”或“gastric neoplasm”或“gnastric cancer”或“stomach cancer”或“GC”，筛 选 流 程见图1。

1.2 纳入与排除标准 文献纳入标准：（1）有关circRNA 低表达的病例对照研究或队列研究。（2）患者被确诊为胃癌。（3）文献内容包括关于circRNA 的表达、基础临床病理参数、预后参数及诊断参数。排除标准：（1）数据重复发表。（2）动物实验、会议摘要、病例报告及综述。（3）无可提取数据。（4）非英语文献。

1.3 数据提取 3名评阅人（刘云、张曼玲和彭洪骄）评估所有录入文献，并独立对数据进行分析。此外，第4 名评阅人（时昭红）在出现数据矛盾时解决分歧。数据提取内容：（1）纳入研究的基本特征，包括第一作者、发表年份、发表国家、研究人群来源、circRNA 名称、病例数、检测方法。（2）从文中直接提取或运用Engauge Digitizer 4.1 软件从生存曲线上获取所需数据，通过计算获得总生存期（OS）的风险比，用于预后分析。（3）在诊断分析中，收集敏感度、特异度和曲线下面积（AUC）。（4）临床病理资料包括年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期、分化程度、淋巴转移等。

1.4 质量评价 文献质量评价根据Newcastle-Ottawa Scale（NOS）进行评估，如果评分≥7 分研究被认为是高质量文献。本研究符合系统审查和Meta分析（PRISMA）声明的首选报告项目。

1.5 统计学方法 所有统计分析均使用Stata 14.0统计软件进行。合并优势比（OR）和95%置信区间（CI）用于评估临床病理参数，敏感度、特异度，危险比（HR）用于评估OS。使用χ2检验和I2统计量评估研究之间的异质性。如果I2值＜50%，则认为不存在明显的异质性。当存在明显的异质性时，采用随机效应模型，否则使用固定效应模型。在本研究中，采用随机效应模型量化合并的敏感度、特异度、诊断优势比（DOR）、阳性似然比（PLR）、阴性似然比（NLR）和AUC，并计算相应的95%CI。进一步进行敏感性分析，以检测结果的稳定性和潜在的异质性来源。漏斗图、Deeks’图用于检测发表偏倚。

Fig.1 Flowchart of the study selection process图1 文献筛选流程及结果

2 结果

2.1 文献检索流程及结果 本次研究在数据库共检索到314篇相关文献，通过阅读全文与摘要，依据本研究的纳入和排除标准，最终筛选出20篇［14-33］合格文献进行Meta 分析，其中7 篇文献用于临床病理特征分析，9篇文献可用于预后分析，16篇文献用于诊断分析，共计2 008例研究对象。

2.2 纳入文献的质量评价 采用NOS 评分标准评价纳入文献的方法学质量，该标准包括3 个方面的评价：病例组与对照组选择方法、病例组与对照组的可比性以及接触暴露评估方法。评价后得分越多质量越高，最高为10 分。20 篇文献中7 篇文献得分8分，10篇文献得分7分，3篇文献得分6分。

2.3 临床病理参数Meta 分析 抑癌circRNA 表达水平降低与较差的临床病理特征显著相关（分化程度：OR=1.33，95%CI：1.14～1.55；TNM 分 期：OR=1.45，95%CI：1.24～1.70；淋巴转移：OR=1.31，95%CI：1.14～1.48；肿瘤大小：OR=1.28，95%CI：1.06～1.54）；而抑癌circRNA 表达水平降低与年龄（OR=0.99，95%CI：0.86～1.12）、性 别（OR=0.98，95%CI：0.89～1.08）无关。

2.4 预后Meta分析

2.4.1 预后Meta 分析文献的基线特征 预后Meta分析共纳入9 篇文献，包括10 种circRNA，所有研究均在中国进行。发表时间从2017—2019 年。每项研究的样本量为51～112。此外，均采用实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测circRNA 的表达水平，见表1。

Tab.1 The main characteristics of included studies for prognosis analysis表1 纳入预后Meta分析文献主要临床数据

2.4.2 总生存率Meta 分析结果 通过汇总9 篇文献［17-20,25，30-33］，10 项总生存率数据，各研究间无明显异质性（I2=0，P=0.811），采用固定效应模型进行分析得出抑癌circRNA 高表达与较好的OS 显著相关（HR=0.37，95%CI：0.29～0.48）。见图2。

Fig.2 Forest plots for overall survival(OS)according to ow-expression of circRNAs图2 低表达circRNA总生存期（OS）森林图结果

Fig.3 The funnel plot of publication bias of included studies图3 纳入研究文献的发表偏倚漏斗图

2.4.3 预后Meta 分析纳入文献的发表偏倚和敏感性分析 对OS绘制漏斗图评价发表偏倚，其结果显示集中趋势明显，不存在发表偏倚，见图3；采用敏感性分析检测各项研究对合并HR 的影响，结果显示合并后HR的结果稳定性良好，见图4。

2.5 诊断Meta分析

2.5.1 诊断Meta 分析文献的基线特征 诊断Meta分析研究的基线特征见表2。诊断Meta分析共纳入16篇文献，包括17种circRNA，所有研究均在中国进行，发表时间从2017—2019年。纳入研究的样本量40～254。均采用qRT-PCR 测量circRNA 的表达水平，试验组的样本均来自胃癌患者；对照组中，胃组织来源均为癌旁正常胃组织，此外对照组血清来源均来自正常人群。

2.5.2 诊断Meta 分析结果 通过汇总16 篇文献［14-29］，21 项总诊断数据，汇总后的敏感度为0.73（95%CI：0.66～0.79；I2=90.67%），特 异 度 为0.77（95%CI：0.68～0.84；I2=92.69%），AUC 为 0.81（95%CI：0.77～0.84）；此外阳性似然比（PLR）为3.13（95%CI：2.32～4.22；I2=84.87%），阴性似然比（NLR）为0.36（95%CI：0.30～0.42；I2=91.74%），DOR 为8.75（95%CI：6.37～12.03；I2=100.0%），见图5。由于各项汇总数据均存在明显异质性，进一步用亚组分析来分析异质性来源，结果显示血清circRNA 的诊断效能高于胃癌组织，见表3。

2.5.3 纳入诊断Meta 分析文献的发表偏倚 采用Deeks’漏斗图对诊断分析各项研究进行不对称检验，未发现发表偏倚（P=0.55），见图6。

Fig.4 The sensitivity analysis of included studies图4 纳入研究文献的敏感性分析图

Tab.2 The main characteristics of included studies for diagnosis analysis表2 纳入诊断Meta分析文献主要临床数据

3 讨论

目前虽然胃癌的病死率已经逐步下降，但是却对患者生活质量造成了极大的影响［34］，这主要是因为早期胃癌症状不显著，常与其他胃肠疾病症状相似，因此延误诊治，从而使得大多数胃癌患者在诊断时已处于Ⅲ期或Ⅳ期末期阶段，不可避免地要进行胃切除手术［35］。而内镜检查及病理检查，虽然能及时发现早期胃癌，但由于其不可避免的侵入性及难以忍受的检查过程，依然难以在临床上广泛开展。因此，迫切需要理想的非侵入性生物标志物来加强胃癌检测。

目前，有关寻找新型肿瘤生物标志物的大量研究表明，胃癌患者和健康对照之间微小RNA（miRNA）表达水平有着明显差异，提示miRNA 可能在癌症抑制中起关键作用［36］。Wei 等［37］通过对48篇文献进行荟萃分析后得出，血清miRNA对于诊断胃癌的敏感度、特异度以及AUC分别为0.76、0.81以及0.86。随后长链非编码RNA（LncRNA）的发现使研究重点发生转移，相关研究发现LncRNA 不仅参与细胞生长、代谢和凋亡等正常的生理过程［38］，也在胃癌的发生、发展过程中发挥着重要的生物学作用，不仅能促进肿瘤血管生成［39］，还参与了胃癌的侵袭和转移等过程［39］。Hu等［40］通过对10篇文献进行荟萃分析发现，LncRNA 诊断胃癌的敏感度为0.63，特异度为0.75，AUC为0.76。

Fig.5 Forest plot of sensitivity and specificity of low-expression of circRNAs for the diagnosis图5 低表达circRNA诊断分析敏感度、特异度森林图

Fig.6 The Deeks’funnel plot of diagnosis of included studies图6 纳入研究文献的诊断分析Deeks’漏斗图

Tab.3 Results of subgroup diagnostic Meta-analysis of low-expression of circRNAs表3 低表达circRNA诊断Meta亚组分析

近年来circRNA 在癌症中的重要作用得到了广泛的认可。从2012 年至今，大量研究报道了circRNA 起源、结构和生物学功能以及其在细胞增殖、转移和肿瘤复发中的作用［9］。同时，circRNAs作为胃癌生物标志物的研究明显增加。Wang 等［41］初步对9 种circRNA 在胃癌中的诊断效能进行荟萃分析，敏感度、特异度以及AUC 分别为0.73、0.72 以及0.78。鉴于circRNA研究的不断深入，以及上述Meta分析文献数量的局限性，本研究共纳入16 篇文献，17 种circRNA 再次进行荟萃分析，探讨了抑癌circRNA 作为胃癌诊断生物标志物的可行性。荟萃分析结果显示：低表达抑癌circRNA 的诊断敏感度为0.73，特异度为0.77，AUC 为0.81，具有较理想的诊断效能，有望成为胃癌的诊断标志物；同时，笔者还进行了亚组分析，在胃癌组织中circRNA 敏感度为0.73，特异度为0.74，AUC 为0.79，而胃癌患者血清circRNA 敏感度为0.73，特异度为0.84，AUC 为0.85，提示与胃癌组织提取的circRNA 相比，血清circRNA 有着较高的诊断效能；同时，血清circRNA诊断效能接近血清miRNA，由于circRNA 为环形结构，与miRNA相比，不易被RNA酶降解，具有更好的稳定性，因此更易作为一种理想的胃癌检测标志物。在各项研究中，circ_PSMC3 具有最佳的诊断效能，其敏感度为0.86，特异度为0.95，AUC 为0.93，并且circ_PSMC3 可通过血液检查获得，具有较好的临床可操作性，可作为胃癌诊断标志物在更多的临床试验中进一步验证。

晚期胃癌虽然经过手术治疗，但仍然有40%～65%患者出现肿瘤远处转移和局部复发［42］，因此临床上同样需要更好的生物指标对术后患者预后做出判断。本研究评估了抑癌circRNA作为胃癌生物预后标志物的意义。在临床病理特征上，抑癌circRNA 的低表达与较差的临床病理特征相关，如肿瘤分化程度、TMN分期、淋巴转移以及肿瘤大小。在预后价值方面，在研究中共对9 篇文献，10 种circRNA 进行了荟萃分析，研究结果提示，低表达抑癌circRNA 的OS 仅为高表达抑癌circRNA 患者的37%。此外，本研究中circ_PVRL3［17］、circ_KIAA1244［18］、circ_PSMC3［19］、circ_0000467［20］、circ_0001017［25］、circ_0061276［25］可作为诊断和预后标志物，其中circ_0001017 不但预示着较差的总生存期（HR=0.29），还具有较好的诊断效能（敏感度=0.76，特异度=0.62，AUC=0.85），是具有临床意义的胃癌标志物。

然而，本研究具有一些局限性：首先，由于circRNA 作为一种较新的非编码RNA，目前所发表的文献依旧不足；此外，同一种circRNA未被不同学者在多个研究中验证，因此获得的数据可能存在偏倚；在诊断荟萃分析中存在异质性，这可能是由于circRNA 检测方法，样本量大小，样本病理特征不一等原因造成的，因此需要更详细的数据进行亚组分析来解释异质性来源；其次，纳入的研究均为队列研究及病例对照研究，文献证据等级有着一定局限性；最后，本研究仅纳入英文文献，不能排除发表偏倚。

综上所述，本研究从Meta 分析角度揭示了低表达抑癌circRNA与胃癌患者的临床病理特征和预后之间的关系。低表达抑癌circRNA可作为一种有效的辅助诊断胃癌的生物标志物。本研究的结论仍需高质量的临床试验证实。