一点红质量标准研究

康兴东，周朝忠，张金良，毛金娣，胡吉忠，刘厚权

（1.江西普正制药股份有限公司，江西 吉安 343100；2.江西省中药消炎药工程技术研究中心，江西 吉安 343100）

一点红原收载于1977 年版《中华人民共和国药典》[6]，但标准中仅做性状检查。此外在广东等省的地方中药材标准中有收载，但无水溶性浸出物和含量测定项[7]。采集12 批一点红药材样品，考察其显微特征、TLC 薄层色谱特征、水分、总灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物和醇溶性浸出物等方面，并测定绿原酸含量，可为该药材质量标准建立和规范使用提供科学依据。

1 试验材料、仪器与试药

1.1 材料

试验所用一点红药材共12 批（其中，产地采集3批，药材市场购买9 批），经江西普正制药股份有限公司吴永忠研究员鉴定为菊科一点红属植物一点红〔Emilia sonchifolia（L.）DC.〕的干燥全草。其中，一部分样用于显微鉴定，另一部分样品经烘干粉碎（100目）后备用。具体信息见表1。

表1 一点红样品信息Table 1 Information

表1 一点红样品信息Table 1 Information

序号No.样品来源Sample source 1 YDH1 广西桂林Guilin,Guangxi Province 2 YDH2 四川成都Chengdu,Sichuan Province 3 YDH3 江西赣州Ganzhou,Jiangxi Province 4 YDH4 亳州药材市场Bozhou Chinese medicine market 5 YDH5 亳州药材市场Bozhou Chinese medicine market 6 YDH6 亳州药材市场Bozhou Chinese medicine market 7 YDH7 亳州药材市场Bozhou Chinese medicine market 8 YDH8 安国药材市场Anguo Chinese medicine market 9 YDH9 安国药材市场Anguo Chinese medicine market 10 YDH10 安国药材市场Anguo Chinese medicine market 11 YDH11 安国药材市场Anguo Chinese medicine market 12 YDH12 安国药材市场Anguo Chinese medicine market编号Code

1.2 仪器设备

美国Waters1525-2489 型高效液相色谱仪；AUW 2200 十万分之一电子分析天平（SHIMADZU 岛津）；AB104-N 万分之一天平（梅特勒-托利多）；JK-300 型超声波清洗仪（合肥金尼克机械制造有限公司）；SK160 Digital 生物显微镜（麦克迪奥光学仪器有限公司）；SX2-4-10 马弗炉（上海实验仪器厂）。

1.3 试剂与试药

绿原酸对照品（110753-200413）、一点红对照药材（121359-201504）购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯，西陇科学股份有限公司）、甲醇（分析纯，天津市恒兴化学试剂有限公司）、磷酸（分析纯，天津市恒兴化学试剂有限公司）、水（自制超纯水）；硅胶G 薄层板（青岛海洋化工厂）。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别

2.1.1 茎横切面特征 表皮细胞一层，呈椭圆形或类方形，木化。棱角处可见木化的下皮细胞，一层。皮层狭窄，薄壁组织中含有较多棕色色素。维管束18～22 束，木质部由导管、木薄壁细胞、木纤维组成，均木化。导管椭圆形或类圆状多角形，直径达60m。髓部宽广，为横切面的2/3，由大形薄壁细胞组成（图1）。

图1 一点红茎横切面Fig.1 Transverse section

图2 一点红粉末图Fig.2 Powder diagram

2.2 薄层色谱鉴别

2.2.1 对照药材溶液的制备 取一点红对照药材1 g，加甲醇20 mL，超声45 min，放冷，过滤，滤液蒸至约2 mL，作为对照药材溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品粉末（过30 目筛）2 g，加甲醇50 mL，超声45min，过滤，滤液蒸至约10 mL，加石油醚萃取3 次，每次15 mL，弃去醚液，余液蒸至约2 mL，作为供试品溶液。

3.2.5 发生锐器伤后上报率有待提高 调查显示，发生锐器伤时，332名中每次上报的只有38.53%，经常上报的只有22.06%，上报率很低。若上报了也只有36.47%的护士进行血清学检测，25%的护士注射了相关免疫疫苗。这一现象既暴露了医院行政部门缺乏对社区护士职业防护的管理，也暴露了社区护士自我保护意识的淡薄，应完善锐器伤上报制度，完善锐器伤的处理流程，加强培训和监管，以利达到对职业暴露的控制与预防。

2.2.3 检测方法 按薄层色谱法[8]试验，吸取上述2种溶液各8L，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水（8∶1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，在105 ℃加热5 min，置紫外光灯（365 nm）下检视，结果见图3。由图3 可知，供试品色谱在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。

2.3 水分、灰分和浸出物检查

按2015 年版《中华人民共和国药典》方法[8]测定，结果见表2，12 批一点红中水分含量为10.0%～11.8%，平均值为10.9%；总灰分含量为8.2%～12.7%，平均值为10.5%；酸不溶性灰分含量为0.3%～3.0%，平均值为1.3%；水溶性浸出物含量为12.3%～18.2%，平均值为15.4%；醇溶性浸出物含量为11.0%～20.2%，平均值为15.4%。

图3 不同批次一点红TLCFig.3 Thin layer chromatography of different batches

表2 水分、灰分和浸出物含量测定结果Table 2 Determination results of water,ash and extract content （%）

2.4 含量测定

2.4.1 色谱条件 Diamonsil C18 柱（250 mm 4.6 mm，5m）；乙腈-磷酸-水（75∶2∶23）为流动相；检测波长327 nm；柱温30 ℃；流量1 mL/min；进样10L。色谱图见图4。

图4 绿原酸HPLC 色谱图Fig.4 HPLC chromatogram of chlorogenic acid

2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取绿原酸对照品

2.24 mg，置50 mL 容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，作为对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液的制备 取本品粉末（过40 目筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加50% 甲醇25 mL，称定重量，超声处理60 min，取出，放冷，称定重量，用50% 甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.4.4 线性关系考察 精密称取绿原酸对照品2.24 mg，置50 mL 量瓶中，加50% 甲醇至刻度，摇匀，作为试验溶液。按色谱条件，分别注入1、2、5、8、10、15 和20L，测定峰面积。以进样量（g）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线并进行回归分析，得回归方程：y=2 121 520x+17 575（r2=0.999 4），绿原酸为0.044 8～0.896 0g，峰面积与样品含量具有良好的线性关系。

2.4.5 精密度试验 精密吸取绿原酸对照品溶液（44.8g/mL）10L，按照“2.4.1”项下的方法重复测定6 次，测得绿原酸峰面积RSD 为0.8%，表明仪器精密度良好。

2.4.6 稳定性试验 将供试品溶液分别于0、1、2、3、5、8 和12 h，按照“2.4.1”项下的方法进样测定，测得样品中绿原酸峰面积RSD 为1.3%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.4.8 回收率试验 取YDH12 的粉末6 份，每份约0.8 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入含绿原酸对照品（浓度2.24g/mL）的50%甲醇25 mL，称定重量，超声提取30 min，放冷，称定重量，用50% 甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。按照“2.4.1”项下的方法进样测定，计算得平均回收率为99.5%，RSD 为0.27%，结果表明本方法具有良好的回收率（表3）。

表3 绿原酸回收率试验结果 （n=6）Table 3 Test results of chlorogenic acid recovery rate （n=6）

2.4.9 样品测定 取本品12 批，每批约1 g，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件进行测定，计算含量，结果见表4。

表4 一点红药材中绿原酸含量测定结果Table 4 Determination results of chlorogenic acid in

表4 一点红药材中绿原酸含量测定结果Table 4 Determination results of chlorogenic acid in

序号 No. 编号 Code 含量（%） Content 1 YDH1 0.037 6 2 YDH2 0.007 0 3 YDH3 0.189 6 4 YDH4 0.010 6 5 YDH5 0.028 3 6 YDH6 0.003 6 7 YDH7 0.016 3 8 YDH8 0.040 5 9 YDH9 0.037 3 10 YDH10 0.007 0 11 YDH11 0.040 1 12 YDH12 0.039 7

3 结果与讨论

3.1 薄层鉴别

试验发现，超声提取和回流提取对供试品制备基本无差别，但超声提取较方便，故选择超声提取。再进行耐用性试验，即对不同薄层板（自制硅胶G 板、预制硅胶G板）；展开系统（乙酸乙酯-甲酸-水=8∶1∶1、甲苯-醋酸乙酯-甲醇-甲酸=1∶8∶1∶1、乙酸乙酯-甲酸-甲醇=8∶1∶1）；点样量（6、8、10L）；温度（5、26 ℃）；湿度（25%、80%）进行考察，发现该条件耐用性较好，相对湿度虽对斑点Rf有一定影响，但都能满足试验要求；3种展开体系均能分离，但乙酸乙酯-甲酸-水=8∶1∶1的展开体系分离效果最好，斑点清晰。

3.2 水分、灰分、浸出物测定

参照2015 年版《中华人民共和国药典》[8]方法，进行了水分、总灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物样品测定，其中醇溶性浸出物采用热浸法，考察了不同醇浓度（50%、75%、95%乙醇）为浸出溶剂时的浸出物的量，结果显示95%乙醇为浸出溶剂浸出效果最好，建议优化浸出溶剂为95%乙醇，醇浸出物（热浸法）不得少于12.0%。此外，感冒炎咳灵颗粒等制剂中一点红为水煎煮提取，故建议增加一点红水溶性浸出物标准，水溶性浸出物不得低于12.0%。

3.3 含量测定

紫外扫描显示绿原酸在327 nm 波长处有最大吸收，故确定检测波长为327 nm。再进行方法学优化，即对不同品牌色谱柱（Sun Flre C18 柱、Diamonsil C18 柱和依利特C18 柱）；提取溶剂（水、50%甲醇、70%甲醇和甲醇）；提取体积（50%甲醇15、25 和50 mL）和提取时间（超声提取30、45 和60 min）进行了考察，发现不同色谱柱对检测结果无影响，并优化确定采用50% 甲醇为提取溶剂、溶剂体积25 mL、超声提取60 min 为供试样品溶液制备方法。此外在线性范围内对高、低浓度取样量的准确度进行考察，低浓度取样量（绿原酸含量为0.405 mg/g 的样品0.4 g）的平均回收率为96.4%（RSD=1.80%）；高浓度取样量（绿原酸含量为1.896 mg/g的样品0.9 g）的平均回收率为96.6%（RSD=1.21%），说明该方法在高、低浓度取样量时的准确度依然良好。