水貂犬瘟热研究概况

孙胜楠，杨春，李铁军，张秀娟，张晓彤，胡博，张琦，郭佳，彭英华※

（1.中国农业科学院特产研究所，吉林 长春 130112；2.东丰县梅花鹿产业发展服务中心，吉林 长春 136300；3.东丰县梅花鹿科技服务中心，吉林 长春 136300）

水貂犬瘟热（canine distemper，CD）是由犬瘟热病毒（canine distemper virus，CDV）感染引起的一种急性、热性、高度接触性传染病[1-2]。发病初期表现为感冒症状，两眼有泪，鼻孔有少量分泌物，临床症状包括呕吐、发热、精神不振、腹泻、脚垫增厚、流涎、甚至死亡。断奶前后的幼貂和育成貂对犬瘟热病毒较为易感，成年貂死亡率为30%～50%，幼年貂死亡率高达80%～90%，是目前危害我国养貂业的重大疫病之一[2-3]。犬瘟热于1809 年首次被报道，我国黑龙江省于1973 年首次报道了水貂犬瘟热的流行，随后逐渐蔓延至全国[3]。该病经常引起混合感染和继发感染，具有“毁灭性传染病”之称，目前水貂犬瘟热在临床上没有特效的治疗药物，只能通过疫苗接种进行免疫预防，然而由于免疫效果不好等原因，造成免疫失败，不仅给养殖场带来了严重的经济损失，而且也给从事毛皮动物饲养、繁殖和疫病防治的工作者带来很大的难题。因此，对其致病机理、检测方法及预防治疗手段进行研究尤为重要。

1 病原学

犬瘟热病毒（canine distemper virus，CDV）属于副黏病毒科，与麻疹病毒（measles virus，MV）、牛瘟病毒（rinderpest virus）、小反刍兽疫病毒（pestedes petits ruminants pestivirus，PPRV）、海豹瘟热病毒（phocine distemper virus，PDV）、海豚瘟热病毒（dolphin distemper virus，DDV）、鼠海豚瘟热病毒（porpoise morbilli virus，PMV）同属于麻疹病毒属成员[4]。CDV 与MV和RPV 在病毒结构和超微形态上几乎完全相同，亲缘关系较近，分子生物学特征和抗原关系十分相似。CDV病毒基因组全长为15 690 bp，分子量为6 106kD，不分节、是非重叠的单股负链RNA 病毒。CDV 病毒粒子形状多样，多呈圆形或不规则状，有时呈长丝状，直径120～300 nm，粒子中心含有直径15～19 nm、螺旋形的核衣壳，核衣壳的成分为N 蛋白、P 蛋白和L 蛋白，并且P 蛋白和L 蛋白具有聚合酶活性[5]。病毒粒子外面为双层囊膜，内部为M 蛋白，起着连接病毒囊膜和核衣壳的作用，囊膜上排列着1.3 nm 的由H 和F两种糖蛋白组成的杆状纤突，两种蛋白在病毒吸附和侵入宿主细胞过程中起一定的作用，二者缺一不可，H蛋白发挥细胞趋向作用，而F蛋白在融合过程中必不可少[6-7]。

CDV 能够在来源于人、犬、貂、猴、鸡的多种原代细胞与传代细胞系上生长繁殖，不同种类细胞繁殖的毒株会有差异，初次培养较为困难，一旦适应某种细胞后在其他细胞上也较易生长。CDV 对犬肺巨噬细胞较为敏感，且分离成功率较高，可形成葡萄样状CPE（细胞病变效应，cytopathic effect）。试验发现，感染CDV后能够使雪貂、乳鼠和犬等发病，其中以雪貂最为敏感，通过连续接种能够增强雪貂的致病力，目前雪貂为公认的CDV 实验动物[8-9]。

CDV 具有病毒的一般特点，适存于偏低温度（负温度值以下），避光环境下生存期能够无限延长，对于高温、光照（日光、紫外线）和干燥的环境抵抗力不强，对酒精、乙醚、甲醛和煤酚皂等有机试剂较为敏感；最适pH 为7.0，在pH 4.5 以下和9.0 以上的酸碱环境下可使其迅速灭活；在2～4 ℃环境下可存活数周，室温存活数天，50～60℃下30 min 就可使其迅速灭活，-70 ℃下可存活数年，冻干可长期保存。养殖场内外环境常用的消毒剂为3%福尔马林、5%石碳酸和3%氢氧化钠等溶液，这些均对病毒具有较理想的杀灭效果[10]。

2 流行病学

水貂犬瘟热的发生没有明显的季节性，一年四季均可发病，夏秋季为多发季节。不同年龄、品种的水貂对犬瘟热病毒均易感染，发病的轻重程度取决于动物的饲养管理水平、自身抵抗力、病原体的数量和毒力以及养殖场的防疫措施等因素。2010～2012 年，王聪等[2]相继检测了山东省诸城、文登、临沂与莱州等地貂场送诊的996 例患病水貂，经CDV 快速检测试剂条与RT-PCR方法确诊为犬瘟热病毒感染的水貂病例有223 例，阳性率为22.39%，其中犬瘟热单独感染为87 例。发病水貂年龄最小的是1 月龄幼貂，3～4 月龄水貂发病率最高，发病季节多在7～8 月。2016 年，张海英等[11]对2011～2013 年河北省乐亭县动物疫病预防控制中心化验室及所属基层站化验室共接诊的1 065 个临床病例进行回顾性分析，通过CDV 快速检测试剂盒以及包涵体检查发现上述的1 065 个病例中，确诊为水貂犬瘟热的病例165例，发病率为15.49%，病死率为68.48%。1～2月龄水貂发病率为8.25%，成年水貂发病率为11.02%，3月龄水貂发病率最高（20.38%）。2014年，山东荣成某水貂场暴发犬瘟热，发病率为70%，死亡率高达50%，造成了严重的经济损失[12]。2020 年，刘彩虹等[13]对2018 年7 月采集的山东某水貂养殖场发病水貂进行犬瘟热病毒分离鉴定及其H 基因序列分析，通过RT-PCR 方法鉴定为阳性，并将阳性病料接种Vero/Dog SLAM细胞进行病毒分离，得到4 株犬瘟热病毒；H基因测序结果表明，水貂养殖场存在多株犬瘟热病毒混合感染的情况。

3 临床症状

由于传染源不同导致水貂犬瘟热潜伏期也不同，当传染源为貂属动物时3～4 周就能引起广泛传播，并且症状严重，死亡率较高（图1）[12]。根据发病的轻重缓急程度，临床上可将犬瘟热病程分为最急性型（猝死型）、急性型、慢性型和亚临床型。最急性型是造成水貂猝死的重要原因之一，常伴有明显的癫痫、肌肉僵直、抽搐和共济失调等神经症状[14-15]。急性型病程为1～10d，发病初期体温升高至39.5～41.5 ℃，出现类似于感冒发烧的症状、皮肤炎症与严重的消化不良，还会突然出现明显的神经症状；哺乳期的幼貂死亡率高达50%以上，育成后期的病貂有一定耐受性，可转为慢性型。慢性型病程一般为2～4 周，典型症状是头、四肢与颈部出现明显病变（疹块），足部会形成明显“硬足掌症”，水貂精神不佳、食欲不良、眼周围干燥脱水严重，眼睛时而睁开、时而粘在一起。亚临床型无明显症状，类似感冒症状，1 周左右可耐过自愈，并能获得免疫力。对病死水貂进行剖检发现，皮肤增厚，脑膜出现出血性炎症，内脏器官出现炎症反应，且胃肠黏膜出现卡他型炎症，肝脏呈樱桃红色、肿大且有血斑，脾脏、肾脏和肺肿大、变形，膀胱出现充血、出血等现象[16-17]。

图1 发病水貂伴有眼睑水肿、有脓性分泌物症状Fig.1 Onset mink with eyelid edema and purulent discharge symptoms

4 诊断方法

4.1 聚合酶链式反应（PCR）

聚合酶链式反应是一种利用引物对病原微生物的特异性基因进行扩增的反应，具有较高的特异性和敏感性，被广泛应用在病原微生物的检测领域。2012 年，Yi 等[18]建立的RT-PCR 检测方法能够鉴别CDV 弱毒疫苗株和野毒株，这一技术对临床流行病学具有重要的指导意义，可以区别出免疫感染和自然感染。同年，张洪亮等[19]进一步优化了RT-PCR 检测方法，建立了一步法检测犬瘟热病毒，大大节省了检测时间，可应用于临床检测大批量样品。2016 年，于红鸽等[20]根据GenBank 中CDV-3N 蛋白基因序列，设计了特异性扩增引物，不断优化PCR 反应体系，建立了一种水貂CDV快速、灵敏的RT-PCR 检测方法。

与RT-PCR 检测方法相比，荧光定量PCR（realtime PCR）具有高度的特异性、灵敏性和可重复性等特点，能够诊断出家畜的多种病毒性疾病，被看作是兽医病毒学和疾病控制的重要工具。2010 年，邢伟明等[21]建立了SYBR Green I 荧光定量RT-PCR 检测方法，能够大规模高通量检测犬瘟热病毒，结果显示检测率和敏感性均高于普通RT-PCR 方法，且具有较好的重复率。2014年，金传松等[22]根据CDV 核衣壳蛋白（NP）基因的保守序列，设计1 对特异性引物和1 条特异性探针，优化了反应体系，建立了TaqMan 荧光定量RTPCR 快速检测CDV 的方法，该方法同样具有良好的稳定性和特异性。2014 年，刘毅[23]针对CDV 的H 基因和犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）的VP2 基因，分别设计了2 对CDV/CPV特异性引物对和2 条TaqMan MGB 探针，建立了CDV、CPV 二重实时荧光定量PCR 检测方法，该方法能够同时对CDV 和CPV进行实时定量分析。荧光定量PCR 虽然灵敏性高，但仪器设备和检测成本相对较贵，不适用于CDV 的临床检测。2018 年，王介淞等[24]以CDV 野毒株N 基因保守区设计引物和探针，建立快速检测水貂犬瘟热病毒的TaqMan 荧光定量PCR 方法。通过敏感性试验、特异性试验、重复性试验和水貂外周血淋巴细胞感染犬瘟热病毒的检测发现该方法可成功检测出水貂外周血淋巴细胞中的犬瘟热病毒。

4.2 免疫学检测

胶体金免疫层析技术（GICT）是一种将胶体金作为示踪标记物，并结合免疫检测技术和蛋白质层析技术，以硝酸纤维膜为载体的快速固相膜免疫分析技术。该技术的关键在于抗体的准备，目前已发展成为CDV诊断试纸条。胶体金技术可在5 min 内完成CDV 的检测，样品采集和操作简单、成本低，不需要特殊仪器设备，方便基层和现场使用以及在临床推广[25-26]。2011 年，房超等[27]考虑到犬源CDV 与水貂源CDV 差异较大，利用水貂源CDV 获得的单克隆抗体，制备了胶体金检测试纸条，发现其特异性良好。

酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种将抗原抗体的免疫反应和酶催化反应相结合的一种免疫学技术，既能检测抗原也能检测抗体，是最广泛的血清学检测方法，具有准确、灵敏、特异、快速、批量检测与成本低等优点，适用于流行病学调查及免疫情况评估，且对临床检测非常有价值。目前，应用于CDV 特异性抗原检测的主要是抗体夹心ELISA 方法，应用于CDV 特异性抗体检测的主要是间接ELISA 方法[28]。2011 年，张鸿等[29]利用2 株CDV 特异性单克隆抗体，建立了夹心ELISA 方法检测CDV 抗原，其具有良好的特异性和敏感性。2013 年，孙婧等[30]利用杂交瘤细胞融合技术获得了CDV 单克隆抗体，建立了单克隆抗体夹心ELISA检测方法，这一方法可快速诊断犬瘟热病毒。在检测CDV 抗体的ELISA 方法中，可以用全病毒包被作为抗原，也可以通过基因工程方法表达重组蛋白作为抗原。2009 年，王吉等[31]使用Vero 细胞体外培养CDV病毒，制备CDV特异性抗原，建立了CDV 抗体的ELISA方法，该方法重复性、特异性、敏感性与稳定性较好，但由于CDV 在细胞的培养滴度低，不易制备，存在传播病毒的安全隐患。2008 年，姜骞等[32]以CDV 重组的N蛋白为包被抗原，建立了间接的CDV抗体的ELISA方法。

4.3 水貂源犬瘟热病毒的分离及鉴定

为研究水貂源犬瘟热病毒的流行毒株，研究人员通过病料处理、病毒分离与培养、病毒TCID50的测定、反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）等方法检测感染细胞中的病毒核酸，进一步通过序列比对、间接免疫荧光（IFA）等方法成功分离并鉴定出犬瘟热毒株。2013 年，徐聪等[33]对来自山东省潍坊市与诸城市某水貂养殖场采集的发病水貂肝、脾、肺和脑等组织进行处理，通过RT-PCR 检测确定是犬瘟热病毒（CDV），同时经测序分析发现该病毒与NCBI 网站上发布的登录号为EF042819、KC590511和KC667070 的毒株同源性均在96%以上，通过细胞培养传代获得病毒1 株，命名为CDV-SD。2014 年，庄金秋等[34]对山东省某貂场疑似CDV 感染的水貂肝脏等组织病料进行了病毒分离、培养及鉴定，并将分离到的毒株命名为CDV LD-1 株。2018 年，赵益超等[35]取某水貂养殖场疑似犬瘟热病毒和细小病毒（MEV）混合感染病料，采用犬瘟热抗原快速检测试纸、HA 和PCR 及RT-PCR 法检测CDV 和MEV，成功分离出一株细小病毒（MEV-RC02 株）和犬瘟热病毒（CDV-RC01 株）。2018 年，王小龙等[36]从来自辽宁省大连市疑似犬瘟热发病死亡水貂病料中成功分离并鉴定出1 株犬瘟热毒株，将其命名为LNDL（17）M4 株。2020 年，刘彩红等[13]从山东某水貂养殖场的发病水貂病料中，通过间接免疫荧光、电镜负染及测序等方法鉴定得到4株犬瘟热病毒，分别命名为WD1、WD2、WX1和WX2 株。

5 水貂犬瘟热的防控

目前，水貂犬瘟热尚无特效的治疗药物，最好的预防方法就是接种疫苗，科学的饲养管理、严格的消毒制度、尽早隔离治疗与定期接种疫苗，对于防治犬瘟热的发生十分重要[14,37]。应用科学的饲料配方，既可以防止水貂出现营养不良的症状，又可以提高水貂的抵抗力。养殖场应按照性别、年龄分散饲养，减少群体之间的接触。疫病发生时，应采取封闭的饲养方式，限制外来人员进入养殖场，隔离饲养患病动物。做好日常笼舍的消毒工作，能够有效清除饲养环境中的病原体。在春季或者犬瘟热病毒流行时期，养殖场应对已发生感染或者患病的水貂立即进行隔离，并对其笼舍进行彻底消毒。养殖场应做到及时隔离治疗患病水貂，以防继发感染的发生。根据患病水貂的体重及个体大小，定量注射犬瘟热高免血清，同时配合使用抗生素、抗病毒类药物进行治疗。严格按照免疫程序接种疫苗，是预防犬瘟热的有效手段。养殖场应在母貂配种前和幼貂断奶后进行接种免疫，并可对断奶后的幼貂适当增加免疫剂量与次数。目前，犬瘟热并无特异疗法，抗生素无效，最好的预防方法就是早发现，早隔离，定期消毒，科学免疫。为防止继发感染，应对患病水貂进行对症治疗，可使用磺胺类和抗生素药物来控制细菌引起的并发症。可使用氯霉素水、妥布霉素等眼药水，用于治疗患病水貂的眼、鼻。对于发生肠胃炎的患病水貂，可在饲料中混入卡那霉素进行治疗，每天2次，每只水貂剂量7 mg/kg（体重）。对于发生肺炎的患病水貂，可通过每日注射15 万～20 万单位的青霉素和链霉素进行控制[14-15]。

6 结语与展望

近年来，我国毛皮动物感染犬瘟热病毒引起的发病率和病死率呈明显升高趋势，给我国毛皮经济动物养殖业造成了巨大的经济损失。目前，对CDV 的研究有很多，但对CDV 在水貂上的感染机制研究尚不充分。应进一步研究CDV在水貂上的感染机制和致病机理，研发出特效治疗药物，制定出合理、有效的治疗方案，对该病的防控将起到较好的推动作用。预防CDV在水貂中流行最有效的方法就是接种疫苗，目前也在研发重组疫苗和亚单位疫苗。但是，由于母源抗体干扰、免疫接种程序不当、疫苗质量不过关、免疫剂量不足等原因，免疫接种失败导致免疫水貂发病的现象一直存在。由此可见，提高养殖场工作人员对科学免疫知识和免疫程序的了解和认知，是预防CDV在水貂中流行暴发的有效手段。对水貂CDV的快速检测技术主要包括ELISA检测试剂盒、胶体金检测试纸条和PCR技术。临床上广泛应用的胶体金检测试纸条，其敏感性和准确性需要进一步提高，且检测过程中容易出现假阳性或者假阴性。分子生物检测方法敏感性和特异性更高，能够应用于早期诊断，但由于设备和操作技术要求高，在基层和临床应用上普及较为困难。因此，研发一种成本低、操作简便快捷的检测方法，对于针对性控制犬瘟热的流行和蔓延具有重要意义。