基于环磷酰免疫抑制模型研究鲜人参膏增强小鼠免疫力的作用

王文婷，施展，林向辉，林晓熙，刘喜峰，任珅，李伟※

（1.吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118；2.辽宁熙峰药业集团有限公司，辽宁 桓仁 117000）

免疫力是人体自身的防御机制，是维持机体内环境稳定的重要保障，其作用体现在当人体自身受细菌、病毒或病原体入侵时，自身免疫系统所具有的抵抗能力[1]，也是评价机体抵抗疾病的关键屏障。一旦免疫力低下或抵抗能力异常，其侵袭的病原体将直接影响机体内环境，从而感染疾病，因此增强免疫力变得尤为重要。增强免疫力通常通过一定手段来加强自身免疫力，也是许多药物治疗疾病或者改善临床药效的目的之一，近年来大量研究表明天然药物在增强机体免疫力方面有着非常显著的效果[2]。

人参为五加科人参属（Panax ginseng C.A.Meyer）植物的干燥根及根茎，是我国极具传统特色的中药资源，具有药用和营养双重价值，素有“百草之王”美誉[3]，其性甘、味微苦，归脾、肺、心经；具有安神益智、大补元气和补脾益肺之功效，久服可以增强其自身免疫力[4]。其主要化学成分为人参皂苷，还包括人参多糖、氨基酸和黄酮类等多种化学成分[5]，是发挥人参多重药理作用的物质基础。近年来，随着人参被列为新资源食品，其食用价值逐渐得到人们的广泛关注，人参系列产品应运而生，例如今幸人参胶囊和人参饮料等。根据人参独特的加工方法和药用价值，蒸参水和人参须等加工产品也逐步得到应用，进一步丰富了人参的开发价值。同时，利用人参精深加工产品，提高机体防御能力和抗病毒能力，更符合现代“以食为养、以食为疗”的养生理念。因此，开发人参功能性食品对于促进人参相关制品的深度开发具有重要的现实意义。

膏剂不仅是传统中成药的主要剂型之一，而且是功能性食品的首选剂型。根据机体不同体质及临床反应，通过煎熬等方式并加入某些辅料制成一种稠膏状剂型，可充分体现膏剂治疗、滋补和易于吸收的特点。鲜人参膏（fresh ginseng paste,FGP）利用国家发明专利技术[6]，精选优质新鲜人参，利用鲜人参不同部位的加工方法，以蒸须水为溶剂，并配以红枣精华，科学加工，转化稀有活性物质，成功富集出以Rg3 为代表的16 种稀有皂苷组分群，最大限度地保留了人参中所有活性成分和营养物质[7]，同时更富含精氨酸双糖苷AFG、氨基酸、多糖和人参蛋白等多种有益物质[8]。

人参加工制品因其富含人参皂苷并具有显著的生理活性，是医疗和保健的首选佳品，更能体现人参独特的药用和食用价值。本研究基于人参的现代研究背景，探究人参新型加工品“鲜人参膏”对环磷酰免疫抑制模型增强小鼠免疫力的作用，以期为人参功能性食品的开发提供理论基础，进一步丰富人参系列深产品的开发利用。

1 材料与方法

1.1 仪器、材料与试剂

Neofuge 1600R 高速离心机（上海力新仪器有限公司）；SPECTRO star Nano 全波长扫描式酶标仪（德国BMG LABTECH 公司）；超净工作台（苏州安泰公司）；Leica DM 500 显微镜（德国徕卡公司）；HERACELL 240i CO2 培养箱（美国Thermo 公司）。

鲜人参膏（FGP），购自辽宁熙峰药业集团有限公司，合格证号SC10721052200667；刀豆蛋白A（Con A）、脂多糖（LPS，批号L2880），均购自美国Sigma 公司；二苯基四氮唑溴盐（MTT），购自美国Sigma 公司；二甲基亚砜（DMSO），购自北京化工厂；小牛血清，购自杭州四季青公司；RPMI1640培养基；白细胞介素2（IL-2）和肿瘤坏死因子（TNF-）试剂盒，购自美国R&D 公司。

BALB/C 小鼠（雌性，20～25 g）和ICR 小鼠（雌性，18～22 g），由长春亿斯实验动物有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 动物分组 取适应性饲养1 周后的ICR 小鼠50 只，随机分为正常对照组（N），CTX 免疫抑制模型组（CTX），CTX+FGP 高剂量组（600 mg/kg，FGP-H）、中剂量组（300 mg/kg，FGP-M）、低剂量组（150 mg/kg，FGP-L），FGP 用生理盐水配制成混悬液，每天灌胃1 次，连续30 d。模型组（M）及给药组于第1、2、3、9、16和23 天腹腔注射80 mg/kg 的CTX。

1.2.2 免疫抑制小鼠脏器指数的测定 经给药30 d，进行小鼠眼球采血，离心并分离血清，做好分装后待用。小鼠处死，收集脏器并称重，计算其胸腺指数和脾脏指数。

脏器指数（%）=脏器重量（g）/体重（g）100

1.2.3 体外淋巴细胞增殖试验 取BALB/c小鼠处死，用75%的乙醇消毒，取出脾脏并用Hanks'液洗，研磨脾脏过200 目筛网，计数，配成2 106mL1细胞悬液待用。试验分为空白组、阴性对照组、阳性对照组和样品组FGP 5 个浓度，分别为FGP（12.5、25.0、50.0、100.0和200.0g/mL）。将制备好的细胞悬液除空白孔加入100L 培养基，其余每孔均加100L 细胞悬液于96孔板中，每组3 个重复，将96 孔板置培养箱中培养1 h后取出。空白组和阴性对照组中各加入100L培养基，阳性对照组浓度加入10LCon A（50g/mL）置于37℃、5% CO2 孵箱中培养48 h 后取出，每孔加20L MTT（5 mg/mL），继续培养4 h 后，吸去上清，加入150L DMSO 充分溶解，使用酶标仪测定各孔OD值（490 nm）。

1.2.4 淋巴细胞转化试验 在制备脾细胞悬液的基础上，进行淋巴细胞转化试验，其小鼠处理方法与“1.2.3”相同，试验共分3 组进行：第1 组脾细胞自然转化，不加刺激剂；第2 组加入Con A 刺激T 细胞转化；第3组加入LPS 刺激B 细胞转化。试验分为空白孔、自然转化孔、Con A刺激孔和LPS 刺激孔，每孔设3 个复孔。将各组细胞分别加入96 孔板中，空白孔和自然转化孔分别加入100L 培养液，ConA刺激孔加入100L 浓度为5.0g/mL Con A，LPS 刺激孔加入100L 浓度为10.0g/mL 的LPS[9]。按照上述方法测定MTT。

1.3 数据处理

试验数据均用Mean±SD 表示，采用单因素方差分析法（ANOVA）进行统计分析，采用GraphPad Prism 6.0.4 软件进行方差分析并绘图。P＜0.05 或P＜0.01认为有统计学差异。

2 结果与分析

2.1 FGP对CTX致免疫抑制小鼠脏器指数的影响

在试验过程中，正常对照组和试验组小鼠生长状况良好。如表1 所示，与正常对照组相比，免疫抑制模型组胸腺指数与脾脏指数均明显降低（P ＜0.05）。与免疫抑制模型组相比，低、中和高剂量FGP 组胸腺指数以及脾脏指数降低情况均有明显改善（P ＜0.05），表明FGP 具有增强小鼠免疫力的作用。

表1 FGP 对CTX 致免疫抑制小鼠脏器指数的影响Table 1 Effect of FGP on organ index of CTX-induced immunosuppressed mice

2.2 FGP 对体外小鼠淋巴细胞转化的影响

FGP 给药组选用5种不同的给药浓度（12.5、25.0、50.0、100.0 和200.0g/mL）作用于小鼠淋巴细胞48 h后，采用MTT 法检测了不同浓度FGP 对小鼠淋巴细胞的细胞毒性，结果如图1 所示：随着FGP 浓度的逐渐增加，BALB/c 小鼠淋巴细胞转化率逐渐升高，且呈现出较明显的剂量依赖（图1）。

2.3 FGP 对CTX 致小鼠淋巴细胞转化率的影响

小鼠FGP 连续灌胃30 d，刺激剂为Con A 和LPS，FGP 对CTX 致小鼠淋巴细胞转化率的影响如图2 所示。从图2 可以看出，低、中剂量FGP 组与CTX 组相比均有显著差异（P ＜0.05），高剂量FGP 组与CTX 组相比小鼠淋巴细胞转化率明显提高（P ＜0.01），表明FGP 能够提高淋巴细胞的自然转化。

图1 FGP 对体外小鼠淋巴细胞转化的影响Fig.1 Effects of FGP on transformation of spleen lymphocytes in mice

2.4 FGP对CTX致小鼠血清中IL-2和IFN-水平的影响

如图3 所示，与正常对照组（N）相比，CTX组小鼠血清中IL-2 与IFN-含量均显著降低（P ＜0.05）；低剂量FGP 组（FGP-L）小鼠血清中IL-2 和IFN-含量有一定的升高，但与CTX 组相比无显著差异。与CTX组相比，中剂量FGP 组（FGP-M）血清中IL-2 和IFN-含量均有显著提高（P ＜0.05）。高剂量FGP 组（FGPH）的IL-2 含量与CTX 组相比极显著升高（P ＜0.01）；高剂量FGP 组（FGP-H）的IFN-含量与CTX 组相比显著升高（P ＜0.05）。

图2 FGP 对CTX 致小鼠淋巴细胞转化率的影响Fig.2 Effects of FGP on transformation rate of lymphocytes in mice induced by CTX

图3 FGP 对CTX 致小鼠血清中IL-2 和IFN- 含量的影响Fig.3 Effects of FGP on IL-2 and IFN- contents in serum of miceinduced by CTX

3 讨论

本研究基于环磷酰免疫抑制模型研究了鲜人参膏增强小鼠免疫力的作用，结果表明，FGP 能够增强BALB/c 小鼠淋巴细胞的体外转化，在给药30 d 后小鼠胸腺指数及脾脏指数明显提高。随着FGP浓度的升高，小鼠淋巴细胞的转化率也随之升高，呈现出一定的剂量依赖关系，也表明高剂量FGP组淋巴细胞的转化率相对较高；低、中剂量FGP在促进免疫抑制小鼠淋巴细胞转化上均起到显著的促进作用；中、高剂量FGP 能够明显提高免疫抑制小鼠血清中IL-2和IFN-的水平。

CTX是目前常用的抗肿瘤药物，也是临床上常用的免疫抑制药物，能通过抑制细胞增殖达到治疗各种自身免疫性疾病的效果[10]。通过CTX 可以建立小鼠免疫抑制模型，而导致其机体免疫功能下降的原因涉及T 细胞、B 细胞异常分化等诸多方面。本试验主要针对CTX 诱导的免疫抑制模型，通过观察与免疫相关的器官和指标，探究不同浓度的FGP 对小鼠机体免疫功能的影响。胸腺是T细胞分化成熟的场所，同时也是机体的中枢免疫器官；脾脏是机体最大的外周免疫器官，当抗原刺激机体后，免疫细胞（T 细胞、B 细胞和巨噬细胞）过度增生，导致其体积增大；二者均为机体的主要免疫器官[11]。淋巴细胞转化率是评价细胞免疫功能的一个重要指标，淋巴细胞只有向成熟T 淋巴细胞转化才能发挥免疫效应[12]。IL-2 是免疫系统中的一类细胞生长因子，对于细胞免疫应答具有明显的促进作用，是细胞免疫水平的一个重要指标[13]；IFN-是细胞被病毒感染时产生的一类细胞因子，在细胞免疫过程中，高剂量的IFN-起抑制作用，而低剂量的IFN-起促进作用，其调节免疫功能主要通过巨噬细胞的激活来实现[14-15]。

人参是我国一种珍贵的滋补性药物资源，红枣更具有“天然维生素”的美誉，而FGP 是将人参与红枣二者加工并通过独特专利技术制成的，富含16 种稀有皂苷及其多种活性物质，为其强大的药理活性提供了物质保证[5]。人参中发挥免疫调节作用的主要是人参皂苷Rg3和Rh2，人参皂苷具有增强其自身的免疫活性分子和改善免疫抑制作用，从而增强其自身免疫力[16]。本试验探究了FGP对CTX 诱导的免疫抑制作用，结果发现FGP能够明显减轻CTX 造成的免疫损伤，有效改善小鼠免疫力低下，从而增强其免疫应答能力。这充分说明FGP 在体内灌胃给药以及体外淋巴细胞转化过程中均起到了显著的保护作用，并产生干扰素，以增强小鼠的免疫调节能力。本研究阐述了FGP 对CTX 诱导免疫损伤具有很好的拮抗作用，初步揭示了鲜人参膏具有较强的免疫调节能力，可为人参及相关产品的精深开发提供理论依据。