白术提取物苍术酮对脂多糖诱导的BV2细胞神经炎性影响及相关机制研究

李 静，金倫喆，金洪光

1九江学院附属医院药剂科，九江 332000；2韩国圆光大学药学院，益山 54641；3九江学院，九江 332000

炎症是免疫防御反应中的重要环节，也是临床中最常见的病症之一。多数疾病的发生、发展过程中都伴随有炎症反应[1]。炎症反应与许多慢性疾病如关节炎、骨质疏松、哮喘、阿尔茨海默病、心血管疾病、痴呆、癌症、肥胖及Ⅱ型糖尿病等密切相关[2]。小胶质细胞在中枢神经系统内分布广泛，是中枢神经系统的主要免疫细胞，在维持中枢神经系统稳态和损伤修复过程中发挥重要作用。小胶质细胞介导的炎症反应在脑缺血、神经退行性疾病等疾病的发生发展过程中起关键作用[3]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)可诱导小胶质细胞表型发生改变并释放一系列致炎性因子如一氧化氮(NO)，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，前列腺素E2(PGE2)，白介素类(ILs)，肿瘤坏死因子(TNF-α)，环氧合酶-2(COX-2)等，引起炎症反应和组织损伤[4]。

白术根茎具有利尿、抗炎、抗肿瘤、抗衰老、止痛、调节免疫、降血糖以及抑制代谢活化酶等作用[5]。苍术酮是白术主要提取物之一，已有研究表明苍术酮对于LPS诱导的RAW264.7有显著抗炎活性作用[6-8]。但是苍术酮对于神经炎性反应影响及其机制尚无研究报道。

本研究以LPS诱导小鼠小胶质细胞BV2建立细胞炎症模型，研究苍术酮预处理对神经炎症相关因子表达的影响并探索其相关信号通路。

1 材料及方法

1.1 药材及试剂

白术药材(根茎生品，韩国)；BV2细胞(韩国圆光大学药学院)；ELISA试剂盒(R&D systems，美国)；anti- iNOS、COX-2、MAPK、NF-κB抗体(Cell Signaling Tecnology，美国)；二抗(Santa Cruz Biotechnology，德国)。

1.2 苍术酮的制备及结构鉴定

取干燥白术根茎(生品)切片2.00 kg，甲醇回流提取2 h，共3次，合并提取液，浓缩后得总浸膏。浸膏加适量蒸馏水分散后，用正己烷萃取回收溶剂后得正己烷萃取物(8.95 g)。再经硅胶柱色谱分离，以正己烷、正己烷-乙酸乙酯、氯仿-甲醇梯度洗脱，得到Fr.H.1～Fr.H.7共7个组分。组分Fr.H.1经Sephadex LH-20柱色谱分离，以正己烷洗脱，得到Fr.H.1.1～Fr.H.1.6共6个组分。组分Fr.H.1.1经硅胶柱色谱分离，以正己烷洗脱，得苍术酮。结构经NMR法进行鉴定。

1.3 细胞存活率检测(MTT法)

BV2细胞于含有10%胎牛血清的RMPI培养液、37 ℃、5% CO2条件下培养。将BV2细胞种植于96孔板，待细胞贴壁后，加入苍术酮终浓度为2.5、5、10、20、40、80、160和320 μM，每组6孔，孵育24 h。细胞处理结束后，加入终浓度0.5 mg/mL MTT溶液，于37 ℃、5% CO2条件下继续培养3 h，吸除上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜溶液(DMSO)，室温振荡15 min，于590 nm处检测吸光度值。

1.4 细胞上清液NO及PGE2、IL-6、TNF-α水平检测

调整细胞悬液为1×105/mL，加入24孔培养板内，待细胞贴壁后，加入苍术酮终浓度为10、20、40和80 μM，对照组加入等体积RMPI培养基，每个样品重复三次，培养3 h后，除对照组外均加入LPS终浓度为1 μg/mL，继续培养24 h后取上清液。Griess法检测NO浓度，上清液加入同体积Griess reagent A及Griess reagent B 1∶1混合溶液，混匀后于540 nm处测定吸光度，根据所测结果绘制标准曲线，计算样品NO浓度。ELISA法检测上清液中PGE2、IL-6、TNF-α含量，按照ELISA检测试剂盒说明书分别检测，根据标准曲线计算样本中炎症因子水平。

1.5 Western blot法检测蛋白表达

1.5.1 COX-2、iNOS总蛋白提取方法

调整细胞悬液为1×106/mL，加入6孔培养板内，待细胞贴壁后，加入苍术酮终浓度为10、20、40和80 μM，对照组加入等体积RMPI培养基，培养3 h后，除对照组外加入LPS终浓度为1 μg/mL，继续培养24 h后提取蛋白，提取液为细胞裂解液。

1.5.2 MAPK、NFκB总蛋白提取方法

调整细胞悬液为1×106/mL，加入6孔培养板内，待细胞贴壁后，加入苍术酮终浓度为10、20、40和80 μM，对照组加入等体积RMPI培养基，培养3 h后，除对照组外加入LPS终浓度为1 μg/mL，继续培养30 min后提取蛋白，提取液为裂解液与磷酸酶抑制剂混合液比率为100∶3。

1.5.3 蛋白检测

总蛋白上样，应用7.5%或12%SDS-PAGE浓缩胶及分离胶进行垂直电泳，45V恒流90 min转膜，5%脱脂奶粉溶液封闭1 h，4℃条件下与一抗溶液孵育过夜，含0.05% Tween-20 TBS溶液洗膜3次，加入二抗溶液于室温条件下孵育1 h，洗涤后ECL显色。

1.6 统计学处理

2 实验结果

2.1 苍术酮结构鉴定

1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.06(1H，s，H-12)，4.88(1H，d，J=1.6 Hz，H-15b)，4.72(1H，d，J=1.6 Hz，H-15a)，2.38～2.44(4H，m，H-3β，6α，9α，9β)，2.31(1H，t，J=13.2 Hz，H-6β)，2.11(1H，dd，J=11.0，5.0 Hz，H-5α)，2.05(1H，td，J=13.2，4.0 Hz，H-3α)，1.97(3H，s，H-13)，1.62～1.72(2H，m，H-1β，2α)，1.57(1H，tt，J=13.2，3.6 Hz，H-2β)，1.52(1H，td，J=12.4，3.6 Hz，H-1α)，0.78(3H，s，H-14)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：149.9(C-4)，149.5(C-8)，137.0(C-12)，119.6(C-7)，116.2(C-11)，107.4(C-15)，45.8(C-5)，42.0(C-1)，39.4(C-9)，37.4(C-3)，36.7(C-10)，23.7(C-2)，21.0(C-6)，17.6(C-14)，8.3(C-13)。

2.2 苍术酮对BV2细胞存活率的影响

正常对照组与苍术酮2.5～80 μM药物组之间细胞存活率无显著差异，160和320 μM药物组细胞存活率显著下降(P<0.001)。表明苍术酮2.5～80 μM对BV2细胞生长状态无显著影响。结果见图1。

图1 苍术酮对BV2细胞存活率的影响Fig.1 Effect of AT on cell viability注：苍术酮给药组与正常对照组比较，***P<0.001。Note:AT group vs control group,***P<0.001.

2.3 苍术酮对LPS诱导BV2细胞NO水平及iNOS蛋白表达的影响

与正常对照组相比，LPS模型组细胞上清液中的NO含量显著增加(P<0.001)；与模型组比较，苍术酮预处理后显著降低细胞上清液中NO水平(P<0.01，P<0.001)。表明苍术酮可有效抑制炎症因子NO的释放。同时，与正常对照组比较，LPS组iNOS蛋白表达明显增高，苍术酮预处理后明显降低。结果见图2和3。

图2 苍术酮对LPS诱导BV2细胞NO含量的影响Fig.2 Effect of AT on Nitrite level of LPS-induced注：LPS模型组与正常对照组比较，#P<0.001；给药组与模型组比较，**P<0.01，***P<0.001。Note:LPS group vs control group,#P<0.001;AT group vs LPS model group,**P<0.01,***P<0.001.

图3 苍术酮对LPS诱导BV2细胞iNOS蛋白表达的影响Fig.3 Effect of AT on iNOS expression of LPS-induced BV2 cells

2.4 苍术酮对LPS诱导BV2细胞上清液PGE2水平及COX-2蛋白表达的影响

与正常对照组比较，LPS模型组细胞上清PGE2含量显著增高(P<0.001)；与LPS模型组比较，苍术酮预处理后均显著降低细胞上清中PGE2水平(P<0.001)。同时，与正常对照组比较，LPS组COX-2蛋白表达明显增高，苍术酮预处理后明显降低。结果见图4和5。

图4 苍术酮对LPS诱导BV2细胞PGE2水平的影响Fig.4 Effect of AT on PGE2 level of注：LPS模型组与正常对照组比较，#P<0.001；给药组与模型组比较，***P<0.001。Note:LPS group vs control group,#P<0.001;AT group vs LPS model group, ***P<0.001.

图5 苍术酮对LPS诱导BV2细胞COX-2蛋白表达的影响Fig.5 Effect of AT on COX-2 expression of LPS-induced BV2 cells

2.5 苍术酮对LPS诱导BV2细胞上清液IL-6水平的影响

与正常对照组比较，LPS模型组细胞上清液IL-6水平显著增高(P<0.001)；与LPS模型组比较，苍术酮预处理后显著降低细胞上清液中IL-6水平(P<0.05，P<0.001)，表明苍术酮可有效抑制LPS诱导BV2细胞IL-6释放。结果见图6。

图6 苍术酮对LPS诱导BV2细胞IL-6水平的影响Fig.6 Effect of AT on IL-6 level of LPS-induced注：LPS模型组与正常对照组比较，#P<0.001；给药组与模型组比较，*P<0.05，***P<0.001。Note:LPS group vs control group,#P<0.001;AT group vs LPS model group,*P<0.05, ***P<0.001.

2.6 苍术酮对LPS诱导BV2细胞上清液TNF-α水平的影响

与正常对照组比较，LPS模型组细胞上清液TNF-α水平显著增高(P<0.001)。与LPS模型组比较，苍术酮预处理后均显著降低细胞上清液中TNF-α水平(P<0.001)，表明苍术酮可有效抑制LPS诱导BV2细胞TNF-α释放。结果见图7。

图7 苍术酮对LPS诱导BV2细胞TNF-α水平的影响Fig.7 Effect of AT on TNF-α level of LPS-induced注：LPS模型组与正常对照组比较，#P<0.001；给药组与模型组比较，***P<0.001。Note:LPS group vs control group,#P<0.001;AT group vs LPS model group,***P<0.001.

2.7 苍术酮对LPS诱导BV2细胞蛋白MAPK表达的影响

与正常对照组比较，LPS组ERK、JNK、p38磷酸化蛋白表达均明显增高，苍术酮预处理后，可明显降低JNK磷酸化蛋白表达，可明显降低ERK磷酸化蛋白表达。然而对p38磷酸化蛋白表达无明显影响。结果见图8。

图8 苍术酮对LPS诱导BV2细胞MAPK蛋白表达的影响Fig.8 Effect of AT on MAPK expression in LPS-induced BV2 cells

2.8 苍术酮对LPS诱导BV2细胞蛋白NF-κB蛋白表达的影响

与正常对照组比较，LPS组细胞质和细胞核总p65磷酸化蛋白，IκB-α磷酸化蛋白表达均明显增高，IκB-α蛋白表达明显降低。苍术酮预处理后可明显降低总p65，IκB-α磷酸化蛋白表达，同时增加IκB-α总蛋白表达。结果见图9和10。

图9 苍术酮对LPS诱导BV2细胞NF-κB蛋白表达的影响Fig.9 Effect of AT on NF-κB expression in LPS-induced BV2 cells

图10 苍术酮对LPS诱导BV2细胞NF-κB蛋白表达的影响Fig.10 Effect of AT on NF-κB expression in LPS-induced BV2 cells

3 结论

来研究发现白术及其提取物有明显的抗炎作用。一些研究表明白术提取物白术内酯具有抗阿尔默茨海默症、帕金森病以及神经保护作用[9,10]。苍术酮作为白术挥发油中主要物质之一，最早和白术内酯一起被发现有抗炎作用[11]。多个研究报道中，苍术酮对于LPS诱导的RAW264.7有显著抗炎作用[6-8]。但是苍术酮对于神经炎性反应影响及其机制尚无研究报道。

小胶质细胞是中枢神经系统的主要免疫细胞，受到异常如LPS等刺激后会产生一系列致炎因子，进而发展为神经炎性及神经退化性疾病。炎症因子是炎症反应中重要的细胞活性因子，它们对细胞炎症都有直接或间接的作用，彼此之间也产生影响[12]。在神经炎性反应中，产生的致炎因子包括一氧化氮(NO)，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)，环氧合酶-2(COX-2)，前列腺素E2(PGE2)，白介素类(ILs，如IL-6)，肿瘤坏死因子(TNF-α)等。iNOS是NO合成酶，它的表达直接决定NO分泌量，是炎症反应检测的一个重要指标[13]。COX可以催化花生四烯酸生成前列腺素H2(PGH2)，而PGH2是前列腺素的前体。COX有三种类型的同工酶，其中COX-2与炎症的关系最为密切[14]。本实验结果表明，LPS诱导BV2细胞上清液中NO、PGE2、IL-6和TNF-α炎症因子表达和细胞中iNOS、COX-2蛋白表达显著增加。而苍术酮预处理能够剂量依赖性分别减少NO、PGE2的生成及减少iNOS、COX-2蛋白表达，以及抑制炎症因子IL-6和TNF-α的释放，此结果表明苍术酮对细胞炎症反应具有显著抑制作用。

LPS触发NF-κB和MAPK通路。NF-κB是一种控制DNA转录的蛋白复合体，在炎症及免疫反应中起着关键作用，包括调控致炎因子iNOS和COX-2基因的表达[15]。正常条件下NF-κB复合体位于细胞质中，由kB-α(IkB-α)和p50/p65组成，被激活后IkBa磷酸化并降解，于是NF-kB从细胞质NF-kB/IkBa复合物中释放出来，NF-kB p65亚单位上的S536发生磷酸化的反应，从而使游离状态的NF-kB进入细胞核中，与靶向的DNA进行结合，促进炎症因子IL-6、TNF-α等的大量表达[16]。该实验LPS刺激后BV2细胞包括细胞质和细胞核中总p65磷酸化蛋白表达增加，细胞质中IkB-α磷酸化蛋白表达增加同时IkB-α降解增加，而苍术酮可抑制此两者磷酸化表达同时减少IkB-α降解。结果表明苍术酮可通过NF-κB通路抑制炎症的发生。

MAPK通路是从细胞表面传导到细胞核内部的重要传递者，是细胞增殖、应激、炎症、凋亡等信号转导通路的共同交汇通路之一，主要亚族包括ERK、p38和JNK[17]。在刺激条件下MAPK通路蛋白磷酸化，并激活NF-kB通路，另外MAPK通路也可通过调节其他转录因子如CREB、AP-1、Elk-1等发生炎症反应[18]。本实验中LPS组ERK、JNK和p38磷酸化蛋白表达均明显增高，苍术酮可明显降低JNK和ERK磷酸化蛋白表达，然而对p38磷酸化蛋白表达无明显影响。表明苍术酮可通过ERK、JNK通路抑制炎症的发生。

苍术酮可显著预防及抑制细胞炎症反应，其机制与炎症通路ERK、JNK和NF-κB有关。未来将基于TLR4/MyD88 /Nf-κB炎症通路进行深入研究。