白薇化学成分及其抗烟草花叶病毒活性研究

晏 英，汤 磊，王建塔，胡嘉琪，徐 冉，朱高峰，郝小江

1贵州医科大学医药卫生管理学院，贵阳 550025；2贵州医科大学 贵州省化学合成药物研发利用工程技术研究中心，贵阳 550004；3贵州医科大学 省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室，贵阳 550014

植物病毒是危害农作物的一类重要病原，因其危害大、防治困难，俗有植物癌症之称。由于植物病毒对植物细胞的绝对寄生性，病毒复制所需要的物质、能量场所等完全由寄主提供，病毒能够胁迫寄主细胞的生化机理，使其与病毒本身的生化机理纠缠在一起难以识别，所以药物难以只对病毒进行选择性攻击而不伤害寄主细胞，导致研究高选择性的化学抗病毒制剂面临极大的困难，至今仍未取得重大突破，尚未出现国际公认的抗TMV(tobacco mosaic virus，TMV)药物[1]。烟草花叶病毒是其中最具代表性的病毒，该病毒发现110年以来，已发现可感染的植物高达500种以上。烟草花叶病毒病是烟草生产上的严重病害，烟草及其他农作物感染TMV后，叶片叶绿素被破坏，光合作用减弱，生长受抑制，造成植株生长困难，畸形、矮化，甚至死亡。TMV的防治较为困难，可导致农作物减产幅度为20%～80%，全球每年因TMV造成的损失可达数亿美元[2]。烟草病毒病的发生日趋严重，抗病毒制剂的研发和使用对于防治该病具有重要意义。

目前，传统的抗病毒制剂往往效果不佳，或者对植物有毒害作用。运用基因工程技术开发转基因抗病品种，如弱毒疫苗卫星核酸等又存在一定争议，不容易被采纳。植物源活性物质抗病毒效果良好，其治疗效果不亚于化学合成制剂，且资源丰富，绿色环保，不会造成环境污染和残留毒性问题，具有广阔的发展前景[3]。目前，从植物中分离得到的倍半萜内酯、柠檬苦素、苦木素、石蒜生物碱、3-acetonyl-3-hydroxyoxindole(AHO)等化合物均有很强抗TMV活性，从植物中分离纯化化合物(即天然产物)，筛选具有抗病毒活性的化合物，已经被证实是一种有效对抗植物病毒的方法[4-6]。前期，课题组研究萝藦科植物抗TMV活性成分的过程中，应用TMV活性追踪法，分离得到的抗TMV活性成分seco-pregnane类甾体苷。深入研究发现，该类化合物高选择性地抑制TMV病毒亚基因组RNA的表达，而对病毒基因组RNA没有影响[7]，此类化合物对TMV新颖的作用机制，有望突破抗植物病毒剂的瓶颈。同时植物中存在的化学防御物质对植物本身的自毒性是较小的，同时具备特殊的识别病毒与寄主植物的能力，将有利于发现和研究新的抗病毒制剂。为了继续寻找抗TMV的活性化学成分，进一步开展萝藦科白薇植物的化学成分研究和抗TMV活性研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂

Bruker AM-400，Bruker AV-600 MHz核磁共振仪(德国布鲁克公司)；Bruker HTC / Esquire 质谱仪(德国布鲁克公司)；旋转蒸发仪(东京理化，N-1300D-WD)；Agilent 1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦科技司)；BP211D电子天平(Sartorouius公司)；色谱柱Waters sunfire C18(10 × 150 mm，4.6 × 250 mm)(沃特世公司)； Sephadex LH-20(美国GE公司)；C18反相硅胶(日本 YMC 公司)；正相硅胶和薄层色谱板(青岛海洋化工厂)；核磁用氘代试剂(美国CIL氘代试剂)；液相用水(娃哈哈纯净水20181109)；色谱级甲醇(科密欧试剂公司)；化学实验用溶剂为工业重蒸溶剂，显色剂为8%的硫酸乙醇溶液。

1.2 实验材料

供试毒源：TMV(U1)普通株系，中国科学院武汉病毒研究所提供。保存于-20 ℃，临用时取出用0.01 M PB稀释至50 μg/mL。

供试寄主：TMV 局部枯斑寄主心叶烟(Nicotianaglutinosa)，本研究组自行培育，漂盘育苗，无虫温室中培育。挑选 6～8片叶龄，大小相似的健康植株作为实验材料。

供试化合物：从白薇中分离得到十个化合物，用DMSO溶解成10 mg /mL的母液于4 ℃存备用。选用宁南霉素(ningnanmycin)作为阳性对照药物。

样品购于贵州省贵阳市万东桥药材市场，经过贵阳中医学院孙庆文老师鉴定为白薇，凭证标本(BW2011～09)保存于贵州医科大学省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室。

2 实验方法

2.1 化合物提取与分离

干燥的白薇全株30 kg，粉碎后用90%的乙醇热回流提取3次，每次时间为2 h，过滤，合并三次提取液，经浓缩后得粗提物约4.5 kg，加水混溶成浑浊液体，先后用石油醚、氯仿等体积萃取3次，得到萃取液后分别浓缩，最终得石油醚部位萃取物(0.8 kg)、氯仿部位萃取物(1.63 kg)。氯仿部分经过硅胶柱层析，用石油醚/丙酮(30∶1→5∶1)和二氯甲烷/甲醇(15∶1→1∶1)快速梯度洗脱得到Fr1～Fr10 共10个部分，其中Fr4(98 g)再次以二氯甲烷/甲醇(30∶1→5∶1)梯度洗脱，分成5个亚部分，分别为Fr4-1～Fr4-5。其中 Fr4-2经过凝胶柱层析(氯仿∶甲醇=1∶1)得化合物1(19.0 mg)。Fr4-3通过反相柱层析 洗脱(甲醇∶水=758∶25)，再经过硅胶柱层析(石油醚/丙酮=5∶1)及HPLC分离(流动相为甲醇∶水=82∶28，流速为2 mL /min)得化合物2(12.7 mg)和4(9.2 mg)；Fr4-5通 过反复硅胶柱层析(石油醚/丙酮=5∶1)得到化合物3(18.9 mg)。Fr5(119 g)再次以二氯甲烷/甲醇(20∶1→5∶1)梯度洗脱，分成4个亚部分，分别为Fr5-1～Fr5-4。Fr5-1经过反相柱层析洗脱(甲醇∶水=60∶40)，再经过HPLC 制备分离(流动相为甲醇∶水=80∶20， 流速 2 mL/min)得化合物6(14.1 mg)和8(13.8 mg)；Fr5-2通过凝胶柱层析(纯甲醇)再经过硅胶柱层析(石油醚/丙酮=6∶1)得化合物5(1.2 g)；Fr5-3通过凝胶柱层析(纯甲醇)及高效液相色谱(流动相为甲醇∶水=78∶22，流速为2 mL/min)制备分离纯化，得到化合物7(10.7 mg)；Fr6(67 g)再次以二氯甲烷/甲醇(15∶1→5∶1)梯度洗脱，分成5个亚部分，分别为Fr6-1～Fr6-5。Fr6-1通过反复硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇=10∶1)后析出沉淀得到化合物10(321 mg)，Fr6-2经过反相柱层析洗脱(甲醇∶水=60∶40)，再通过凝胶柱层析(纯甲醇)再经过硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇=15∶1)得化合物9(89 mg)。

2.2 化合物活性筛选

2.2.1 化合物对TMV的钝化作用实验

挑选健康长势一致的5～6叶期的心叶烟，暗室放置一夜。将供试化合物与50 μg/mL的TMV 1∶1(V/V)混合至所需浓度，混匀放置0.5 h。每棵烟挑选大小相似的4～6片叶子，每片叶子的一半摩擦接种化合物与TMV的混合溶液100 μL作为处理；另一半摩擦接种50 μg/mL的TMV100 μL作为阳性对照；摩擦接种相应浓度DMSO溶液的叶片作为空白[8]。2 h后用无菌水将叶表面的金刚砂洗净。放入无虫温室中，3～4天后按公式计算：TMV抑制率=[1-(处理的平均枯斑数/阳性对照的平均枯斑数)]×100%。每个化合物重复三次。

2.2.2 化合物对TMV的保护作用实验

挑选健康长势一致的5～6叶期的心叶烟，暗室放置一夜。每棵烟挑选大小相似的4～6片叶子，供试化合物用无菌水稀释为所需浓度，每片叶子的一半均匀施药100 μL作为处理，24 h后每片叶子摩擦接种200 μg/mL TMV 200 μL，未施药的一半作为阳性对照，未施药且摩擦接种相应浓度DMSO溶液的叶片作为空白。2 h后用无菌水将叶表面的金刚砂洗净。放入无虫温室中，3～4天后按公式计算TMV抑制率=[1-(处理的平均枯斑数/阳性对照的平均枯斑数)]×100%。每个化合物重复三次。

图1 化合物1～10的化学结构Fig.1 The chemical structures of compounds 1-10

2.2.3 化合物对TMV的治疗作用实验

挑选健康长势一致的5～6叶期的心叶烟，暗室放置一夜。每棵烟挑选大小相似的4～6片叶子摩擦接种200 μg/mL TMV 200 μL，2 h后每片叶子的一半均匀施药100 μL作为处理；另一半作为阳性对照；未施药且摩擦接种相应浓度DMSO溶液的叶片作为空白。2 h后用无菌水将叶表面的金刚砂洗净。放入无虫温室中，3～4天后按公式计算TMV抑制率=[1-(处理的平均枯斑数/阳性对照的平均枯斑数)]×100%。每个化合物重复三次。

3 实验结果

3.1 结构鉴定

化合物1白色粉末；ESI-MS：m/z687 [M +Na]+，确定分子质量664；分子式C35H52O12；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.26(1H，s，H-18)，5.40(1H，d，J=5.2 Hz，H-6)，5.31(1H，m，H-16)，4.83(1H，d，J=4.0 Hz，H-1′′)，4.50(1H，dd，J=1.6，9.6 Hz，H-1′)，4.21(1H，m，H-5′)，4.18(1H，dd，J=6.8，8.8 Hz，H-15β)，3.88(1H，t，J=9.2 Hz，H-15α)，3.42(3H，s，3′-OCH3)，3.41(3H，s，3′′-OCH3)，1.54(3H，s，H-21)，0.92(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：174.5(C-14)，143.8(C-18)，140.6(C-5)，120.4(C-6)，118.3(C-20)，113.8(C-13)，102.4(C-1′)，98.9(C-1′′)，85.5(C-3′)，80.2(C-4′)，77.8(C-3)，76.0(C-3′′)，75.6(C-16)，75.5(C-2′)，70.0(C-5′)，67.9(C-15)，67.8(C-4′′)，67.5(C-5′′)，60.3(C-7′)，56.1(C-17)，55.0(C-7′′)，52.5(C-9)，40.6(C-8)，38.6(C-10)，38.5(C-4)，36.3(C-1)，30.1(C-2′′)，30.0(C-2)，28.4(C-12)，27.9(C-7)，24.5(C-21)，23.8(C-11)，18.4(C-19)，17.9(C-6′′)，17.6(C-6′)。以上数据与文献[9]报道基本一致，故鉴定化合物1为glaucogenin-C 3-O-α-L-diginopyranosyl-(1→4)-β-D-thevetopyranoside。

化合物2白色粉末；ESI-MS：m/z801 [M +Na]+，确定分子质量778；分子式C41H62O14；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.25(1H，s，H-18)，5.40(1H，d，J=5.2 Hz，H-6)，5.33(1H，m，H-16)，5.03(1H，d，J=8.0 Hz，H-1′′)，4.81(1H，d，J=4.0 Hz，H-1′)，4.55(1H，d，J=8.4 Hz，H-1′′′)，4.18(1H，dd，J=7.2，8.8 Hz，H-15β)，4.05(1H，m，H-5′′)，3.87(1H，t，J=9.2 Hz，H-15α)，3.52(3H，s，3′′′-OCH3)，3.42(3H，s，3′-OCH3)，1.53(3H，s，H-21)，0.92(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：174.3(C-14)，143.6(C-18)，140.8(C-5)，120.4(C-6)，118.4(C-20)，114.5(C-13)，98.6(C-1′′)，98.4(C-1′′′)，98.2(C-1′)，82.2(C-4′)，81.0(C-4′′)，79.1(C-3′)，77.5(C-3)，77.4(C-3′′′)，76.5(C-16)，72.6(C-4′′′)，71.8(C-5′)，69.2(C-5′′)，68.0(C-3′′)，67.5(C-15)，66.7(C-5′′′)，57.3(C-7′)，56.7(C-7′′′)，56.2(C-17)，53.1 (C-9)，40.8(C-8)，39.2(C-4)，38.6(C-10)，38.5(C-2′′)，38.1(C-2′)，36.5(C-1)，32.2(C-2′′′)，30.2(C-2)，29.1(C-7)，28.5(C-12)，24.5(C-21)，24.3(C-11)，18.9(C-6′)，18.4(C-6′′)，18.3(C-6′′′)，18.0(C-19)。以上数据与文献[10]报道基本一致，故鉴定化合物2为glaucogenin-C 3-O-β-D-oleandropyranosyl-(1→4)-β-D-digitoxopyranosy1-(1→4)-α-L-cymaropyranoside。

化合物3白色粉末；ESI-MS：m/z851 [M +Na]+，确定分子质量828；分子式C40H60O18；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.26(1H，s，H-18)，5.40(1H，m，H-6)，5.33(1H，m，H-16)，4.97(1H，dd，J=2.0，10.0 Hz，H-1′)，4.49(1H，m，H-1′′)，4.48(1H，d，J=8.0 Hz，H-1′′′)，4.19(1H，t，J=8.0 Hz，H-15β)，3.87(1H，t，J=9.6 Hz，H-15α)，3.46(3H，s，3′-OCH3)，3.43(3H，m，H-5′′)，1.54(3H，s，H-21)，0.92(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：175.6(C-14)，143.9(C-18)，140.8(C-5)，120.7(C-6)，118.4(C-20)，114.4(C-13)，104.3(C-1′′′)，102.9(C-1′′)，98.3(C-1′)，82.4(C-4′)，78.8(C-5′′)，78.4(C-5′′′)，78.2(C-3′′′)，77.6(C-3)，77.6(C-3′′)，77.3(C-3′)，75.6(C-16)，75.4(C-2′′′)，74.5(C-2′′)， 72.5(C-4′′′)，71.9(C-4′′)，71.4(C-5′)，69.3(C-6′′)，67.5(C-15)，66.3(C-6′′′)，57.7(C-7′)，53.5(C-17)，53.3(C-9)，40.8(C-8)，39.1(C-4)，38.8(C-10)，38.1(C-2′)，36.5(C-1)，30.1(C-2)，30.0(C-7)，29.8(C-12)，24.5(C-21)，24.3(C-11)，18.1(C-6′)，18.0(C-19)。以上数据与文献[11]报道基本一致，故鉴定化合物3为glaucogenin-C 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-oleandropyranoside。

化合物4白色粉末；ESI-MS：m/z817 [M +Na]+，确定分子质量794；分子式C41H62O15；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.26(1H，s，H-18)，5.43(1H，d，J=5.2 Hz，H-6)，5.31(1H，m，H-16)，5.02(1H，m，H-1′′)，4.77(1H，dd，J=1.8，9.6 Hz，H-1′)，4.58(1H，d，J=3.6 Hz，H-1′′′)，4.17(1H，t，J=7.2 Hz，H-15β)，3.87(1H，t，J=9.6 Hz，H-15α)，3.42(3H，s，3′′′-OCH3)，3.41(3H，s，3′-OCH3)，1.56(1H，m，H-2′′′β)，1.55(3H，s，H-21)，0.93(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：175.4(C-14)，143.9(C-18)，139.8(C-5)，120.3(C-6)，118.0(C-20)，114.4(C-13)，99.5(C-1′′′)，99.2(C-1′′)，98.6(C-1′)，86.2(C-3)，82.2(C-4′)，80.4(C-4′′)，79.0(C-3′′′)，78.6(C-3′)，75.6(C-4′′′)，75.0(C-16)，72.0(C-5′)，70.5(C-2)，69.5(C-5′′)，69.4(C-5′′′)，67.5(C-15)，67.5(C-3′′)，57.4(C-7′)，57.0(C-7′′′)，55.6(C-17)，50.5(C-9)，43.6(C-1)，40.1(C-8)，39.8(C-10)，39.7(C-4)，38.6(C-2′′)，38.0(C-2′)，35.3(C-2′′′)，29.8(C-12)，29.6(C-7)，24.5(C-21)，24.3(C-11)，18.1(C-19)，18.1(C-6′)，18.0(C-6′′)，18.0(C-6′′′)。以上数据与文献[12]报道基本一致，故鉴定化合物4为glaucogenin-A 3-O-α-L-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-digitoxopyranosyl-(1→4) -β-D-oleandropyranoside。

化合物5白色粉末；ESI-MS：m/z831 [M +Na]+，确定分子质量808；分子式C42H64O15；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.27(1H，s，H-18)，5.40(1H，d，J=5.4 Hz，H-6)，5.33(1H，m，H-16)，4.97(1H，dd，J=1.8，9.6 Hz，H-1′)，4.80(1H，d，J=3.6 Hz，H-1′′′)，4.47(1H，dd，J=1.8，9.6 Hz，H-1′′)，4.18(1H，t，J=7.2 Hz，H-15β)，3.87(1H，t，J=9.6 Hz，H-15α)，3.47(3H，s，3′-OCH3)，3.42(3H，s，3′′′-OCH3)，3.41(3H，s，3′′-OCH3)，1.53(3H，s，H-21)，0.95(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:175.7(C-14)，143.8(C-18)，140.5(C-5)，120.5 (C-6)，119.0(C-20)，114.3(C-13)，100.5(C-1′′′)，99.3(C-1′)，98.5(C-1′′)，85.8(C-3)，82.6(C-4′)，82.4(C-4′′)，79.2(C-3′′′)，79.0(C-3′)，77.6(C-3′′)，76.9(C-4′′′)，75.6(C-16)，71.4(C-5′)，69.7(C-5′′′)，69.6(C-2)，69.5(C-5′′)，67.5(C-15)，57.5(C-7′)，57.0(C-7′′′)，56.8(C-7′′)，55.5(C-17)，50.2(C-9)，44.5(C-1)，40.3(C-8)，39.5(C-10)，37.8(C-2′)，37.2(C-4)，36.2(C-2′′)，35.8(C-2′′′)，29.8(C-12)，29.6(C-7)，24.5(C-21)，23.7(C-11)，18.5(C-6′′′)，18.3(C-6′)，18.3(C-6′′)，18.1(C-19)。以上数据与文献[13]报道基本一致，故鉴定化合物5为glaucogenin-A 3-O-α-L-diginopyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-oleandrop-yranoside。

化合物6白色粉末；ESI-MS：m/z831 [M +Na]+，确定分子质量808；分子式C42H64O15；1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ：6.27(1H，s，H-18)，5.41(1H，d，J=5.4 Hz，H-6)，5.31(1H，m，H-16)，4.97(1H，d，J=3.6 Hz，H-1′′′)，4.96(1H，dd，J=1.8，9.6 Hz，H-1′)，4.50(1H，dd，J=2.0，10.0 Hz，H-1′′)，4.18(1H，t，J=8.4 Hz，H-15β)，3.87(1H，t，J=9.6 Hz，H-15α)，3.86(1H，m，H-5′)，3.73(1H，m，H-2)，3.46(3H，s，3′-OCH3)，3.43(3H，s，3′′-OCH3)，3.40(3H，s，3′′′-OCH3)，1.54(3H，s，H-21)，0.97(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：175.4(C-14)，143.9(C-18)，139.8(C-5)，120.4(C-6)，118.6(C-20)，114.4(C-13)，98.7(C-1′)，98.5(C-1′′)，98.0(C-1′′′)，85.6(C-3)，82.7(C-4′)，81.6(C-4′′)，79.9(C-3′)，77.6(C-3′′)，76.2(C-3′′′)，75.6(C-16)，73.0(C-4′′′)，72.9(C-5′)，69.6(C-2)，69.5(C-5′′)，67.6(C-5′′′)，67.5(C-15)，58.0(C-7′′)，57.0(C-7′)，56.3(C-7′′′)，56.2(C-17)，52.7(C-9)，44.6(C-1)，39.8(C-8)，39.5(C-10)，37.6(C-4)，37.5(C-2′)，36.8(C-2′′)，32.1(C-2′′′)，29.9(C-7)，29.6(C-12)，24.5(C-21)，23.5(C-11)，18.5(C-6′)，18.0(C-6′′)，17.9(C-19)，17.9(C-6′′′)。以上数据与文献[11]报道基本一致，故鉴定化合物6为glaucogenin-A 3-O-α-L-cymaropyranos-yl-(1→4)-α-L-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-oleandropyranoside。

化合物7白色粉末；ESI-MS：m/z831 [M +Na]+，确定分子质量808；分子式C42H64O15；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.28(1H，s，H-18)，5.43(1H，d，J=5.4 Hz，H-6)，5.29(1H，m，H-16)，5.00(1H，d，J=3.6 Hz，H-1′′′)，4.56(1H，dd，J=1.8，9.6 Hz，H-1′)，4.52(1H，dd，J=2.0，10.0 Hz，H-1′′)，4.18(1H，dd，J=6.8，8.4 Hz，H-15β)，3.87(1H，t，J=8.8 Hz，H-15α)，3.43(3H，s，3′′′-OCH3)，3.41(3H，s，3′-OCH3)，3.40(3H，s，3′′-OCH3)，1.50(3H，s，H-21)，0.94(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：175.1(C-14)，143.8(C-18)，139.7(C-5)，120.3(C-6)，118.1(C-20)，114.1(C-13)，99.0(C-1′′′)，98.6(C-1′′)，97.9(C-1′)，85.2(C-3)，82.0(C-4′)，81.7(C-4′′)，77.8(C-3′′)，77.6(C-3′)，76.3(C-3′′′)，75.5(C-16)，72.8(C-4′′′)，69.6(C-2)，69.3(C-5′)，69.1(C-5′′)，67.5(C-15)，66.8(C-5′′′)，57.4(C-7′)，56.8(C-7′′)，56.5(C-7′′′)，56.4(C-17)，52.3(C-9)，44.3(C-1)，39.9(C-8)，39.1(C-10)，37.7(C-4)，37.1(C-2′)，36.9(C-2′′)，32.0(C-2′′′)，30.0(C-7)，29.6(C-12)，24.7(C-21)，23.8(C-11)，18.5(C-6′)，18.1(C-19)，18.1(C-6′′′)，18.0(C-6′′)。以上数据与文献[14]报道基本一致，故鉴定化合物7为glaucogenin-A 3-O-α-L-cymaropyranosyl-(1→4)-β-L-cymaropyranosyl-(1→4)-β-L-cymarop-yranoside。

化合物8白色粉末；ESI-MS：m/z831 [M +Na]+，确定分子质量808；分子式C42H64O15；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：6.28(1H，s，H-18)，5.43(1H，d，J=5.4 Hz，H-6)，5.31(1H，m，H-16)，4.91(1H，d，J=3.6 Hz，H-1′′′)，4.58(1H，dd，J=3.2，5.2 Hz，H-1′′)，4.56(1H，dd，J=1.8，9.6 Hz，H-1′)，4.18(1H，t，J=7.8 Hz，H-15β)，4.14(1H，m，H-4′′′)，3.87(1H，t，J=9.2 Hz，H-15α)，3.42(3H，s，3′′-OCH3)，3.41(3H，s，3′′′-OCH3)，3.40(3H，s，3′-OCH3)，1.53(3H，s，H-21)，0.95(3H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：174.8(C-14)，144.0(C-18)，139.8(C-5)，120.2(C-6)，117.9(C-20)，114.1(C-13)，98.5(C-1′′)，98.4(C-1′′′)，97.8(C-1′)，85.6(C-3)，81.7(C-4′)，81.6(C-4′′)77.8(C-3′)，76.5(C-3′′′)，76.4(C-3′′)，75.3(C-16)，72.9(C-4′′′)，69.9(C-2)，69.6(C-5′)，69.3(C-5′′)，68.0(C-5′′′)，67.5(C-15)，57.9(C-7′)，57.0(C-7′′)，56.7(C-7′′′)，56.5(C-17)，52.2(C-9)，43.6(C-1)，39.8(C-8)，39.2(C-10)，37.6(C-4)，37.6(C-2′′)，37.0(C-2′)，32.2(C-2′′′)，29.8(C-7)，29.7(C-12)24.4(C-21)，23.8(C-11)，18.1(C-6′)，18.0(C-19)，18.0(C-6′′)，18.0(C-6′′′)。以上数据与文献[15]报道基本一致，故鉴定化合物8为glaucogenin-A 3-O-α-L-cymaropyranosyl-(1→4)-β-D-cymaropyranosyl-(1→4)-β-L-cymaropyranoside。

化合物9黄色粉末；ESI-MS：m/z386 [M +Na]+，确定分子质量363；分子式C23H25NO3；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.91(1H，s，H-4)，7.90(1H，d，J=3.0 Hz，H-5)，7.83(1H，d，J=15.6 Hz，H-8)，7.31(1H，s，H-1)，7.21(1H，dd，J=3.0，12.0 Hz，H-7)，4.71(1H，d，J=18.0 Hz，H-25)，4.10(3H，s，2-OCH3)，4.06(3H，s，3-OCH3)，4.01(3H，s，6-OCH3)，3.70(1H，d，J=18.0 Hz，H-9)，3.46(1H，t，J=12.0 Hz，H-11)，3.36(1H，dd，J=2.4，21.0 Hz，H-15)，2.90(1H，m，H-15)，2.49(1H，m，H-14)，2.45(1H，m，H-11)，2.22(1H，m，H-13)，2.02(1H，m，H-12)，1.92(1H，m，H-12)，1.76(1H，m，H-13)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：157.4(C-6)，149.3(C-3)，148.2(C-2)，130.1(C-8′)，127.0(C-5′)，126.6(C-9′)，125.5(C-15′)，124.2(C-8)，124.1(C-4′)，123.4(C-1′)，114.8(C-7)，104.6(C-5)，103.9(C-1)，103.7(C-4)，60.1(C-14)，55.9(OCH3-2)，55.8(OCH3-3)，55.5(OCH3-6)，55.1(C-11)，53.8(C-9)，33.7(C-15)，31.3(C-13)，21.6(C-12)。以上数据与文献[16]报道基本一致，故鉴定化合物9为antofine。

化合物10褐色粉末；ESI-MS：m/z365 [M+Na]+，确定分子质量342；分子式C12H22O11；1H NMR(400 MHz，DMSO)δ：5.19(1H，d，J=6.0 Hz，H-1′)，5.17(1H，d，J=4.8 Hz，H -1)，5.06(1H，d，J=12.0 Hz，H -1′)，4.80(1H，dd，J=6.0，12.0 Hz，H-6)，4.76(1H，d，J=12.0 Hz，H-6′)，4.50(1H，d，J=12.0 Hz，H-6′)，4.40(1H，dd，J=2.4，12 Hz，H-6)，3.90(1H，t，J=9.6 Hz，H-3′)，3.80(1H，m，H-4′)，3.64(1H，m，H-5′)，3.56(1H，m，H-5)，3.52(1H，m，H-6′)，3.45(1H，d，J=10.2 Hz，H-2)，3.18(1H，m，H-3)，3.13(1H，m，H-4)；13C NMR(100 MHz，DMSO)δ：104.0(C-2′)，91.7(C-1)，82.6(C-5′)，77.0(C-3′)，74.3(C-4′)，72.9(C-3)，72.8(C-5)，71.6(C-2)，69.8(C-4)，62.1(C-6′)，62.0(C-1′)，60.5(C-6)。以上数据与文献[17]报道基本一致，故鉴定化合物10为2-O-β-D-fructofuranosyl-β-D-glucopyranoside。

3.2 化合物抗TMV活性实验结果

白薇全株中分离得到的化合物1～9的抗TMV活性结果见表1，从钝化活性结果来看，化合物1、2、3、9高于宁南霉素，化合物5和阳性对照宁南霉素相当，化合物4、6、7、8低于宁南霉素，表明化合物1、2、3、9在体外能作用于病毒；从保护活性来看，除了化合物8与宁南霉素相当，其余化合物均低于宁南霉素，表明化合物8能诱导烟草获得植物系统抗性抵御病毒；从治疗活性来看，化合物1～4、9高于宁南霉素，化合物5和宁南霉素相当，化合物6～8低于宁南霉素，表明化合物1～4、9能直接作用于病毒，不影响宿主细胞；从钝化活性的IC50值结果来看，化合物1、2、3、9具有较强的抗TMV活性，说明化合物1、2、3、9不是通过诱导植物获得抗性，是通过直接作用于病毒发挥抗TMV活性。结果显示菲骈吲哚里西定生物碱高于seco-pregnane类甾体苷，glaucogenin C类型的二糖苷抗TMV活性高于三糖苷，glaucogenin C类型的三糖苷抗TMV活性高于glaucogenin A类型的三糖苷。说明glaucogenin A苷元母核上的2位羟基能影响抗TMV活性，同类型的甾体含糖越多，活性越低。

表1 化合物1～9的抗TMV活性结果Table 1 Antiviral activities of compounds 1-9 against tobacco mosaic virus

注：宁南霉素为阳性对照药物，a50 μg/mL，b200 μg/mL，c200 μg/mL，d以钝化活性测定IC50值。

Note:Ningnanmycin was used as positive control drug,a50 μg/mL,b200 μg/mL,c200 μg/mL,ddetermination of IC50by inactivation effect.

4 结论

通过应用多种色谱方法从萝藦科植物白薇全株的乙醇提取物中分离得到10个单体化合物，化合物1～8，10为首次从该植物中分离得到。对化合物1～9进行抗TMV活性测试，发现化合物1、2、3、9具有较强的抗TMV活性，其活性高于阳性对照药物宁南霉素，化合物5的抗TMV活性与宁南霉素相当，说明菲骈吲哚里西定生物碱高于seco-pregnane类甾体苷，同类型的二糖苷抗TMV活性高于三糖苷，glaucogenin C类型糖苷活性高于glaucogenin A类型糖苷，且菲骈吲哚里西定生物碱和seco-pregnane类甾体苷的抗TMV活性是通过作用于TMV产生。本研究结果丰富了白薇的化学成分及生物活性内容，为其进一步的研究开发提供理论基础。