数据挖掘中药治疗癫痫药对“陈皮-半夏”及其网络药理学作用机制分析

王晶慧，赵慧亮，靳 翔，侯 璐

1西南大学药学院中医药学院，重庆 400715；2山西大学中医药现代研究中心，太原 030006；3山西农业大学生命科学学院，太谷 030800

癫痫是大脑神经元突然异常放电而致一时性大脑功能失调的慢性综合性神经系统疾病[1]。中医认为癫痫病机为邪闭脑窍、元神失控，治疗癫痫的重点在于调理机体整体功能[2]。中医抗癫痫已有确切的临床实用价值，许多中药和复方的疗效已被大量的临床和实验研究所证实。但中药方剂种类多、配伍复杂，本研究利用数据挖掘与网络药理学探究临床遣方治疗癫痫的用药规律及其作用机制[3]。利用Apriori关联规则算法从现代文献中整理出繁杂、多源化的治疗癫痫药方，得到常用药对“陈皮-半夏”。

半夏、陈皮为祛痰常用药，历代医家认为，癫痫发病以痰为基础，多风、火而触动，阻于心窍而发病，治疗以祛痰为要义。但由于中药多成分、多靶点的特点，“陈皮-半夏”所含化学成分的作用机制尚不明确。网络药理学是在系统生物学与计算机技术高速发展的基础上发展起来的，基于“药物-靶点-疾病”相互作用的网络基础上，用网络分析的方法研究药物作用机理[4]。网络药理学注重药物作用的整体效果，采用网络分析的方法观察药物对疾病网络的干预与影响，为中医药的现代化研究提供了新的指导思想。因此，借助网络药理学方法筛选陈皮、半夏的主要活性成分及其作用靶点，寻找其影响的通路与疾病之间的相关性，对于从宏观角度阐释陈皮-半夏配伍治疗癫痫的作用机制具有重要意义。

本文通过关联规则挖掘得出文献中治疗癫痫使用频率最高的药对“陈皮-半夏”。对陈皮-半夏药对开展网络药理学研究，进一步明确陈皮、半夏活性成分及作用靶点，并分析其治疗癫痫的作用机制，对癫痫的治疗与相关药物的使用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 中药复方的收集

以中国期刊全文数据库、维普数据库、万方数据库为数据来源，运用计算机检索功能输入“癫痫”、“中药 癫痫”、“中医 癫痫”下载相关文献。去重后根据纳入标准和排除标准筛选出符合标准的文献[5]。

排除标准：(1)排除并发症、后遗症类、探讨类、文献内无具体用方类文献；(2)排除中药治疗癫痫的动物类文献；(3)排除治疗小儿癫痫的相关文献；(4)排除非内服，外用治疗类文献；(5)排除利用针灸、推拿治疗癫痫类文献；(6)排除非辨证论治类文献。

纳入标准：(1)所选文献应完整性高、药方完整无缺失；(2)所选文献已进行临床治疗并有一定数量的治愈病例；(3)所选文献为公开发表并明确用于治疗癫痫；(4)所选文献治疗方法为口服。

1.2 运用Apriori关联规则算法挖掘药对

将中药名称标准化后录入Excel表格，例如将“枣仁”“酸枣核”统一命名为“酸枣仁”，将“全虫”“蝎子”统一命名为“全蝎”，建立目标数据库。运用SPSS Modeler软件处理目标数据库内的中药，运用Apriori关联规则算法建立数据挖掘模型，得出使用频率最高的药对[6]。

1.3 药对中所含化学成分的收集与筛选

在传统中药数据库 TCMSP[7](http://tcmspw.com/tcmsp.php)中收集药对的主要化学成分。结合口服生物利用度(OB≥30%)和类药性(DL≥0.18)筛选所收集到的化学成分，建立药对的化学成分数据库[8]。将上面收集到的靶蛋白在数据库UniProt[9](https://www.uniprot.org/)中进行校正，选择物种为人，用靶蛋白的简写表示，建立药物的靶点蛋白数据库。

1.4 癫痫与药对相关靶点的收集

在人类基因数据库Genecards(https://genecards.weizmann.ac.il/v3/)、人类在线孟德尔遗传平台OMIM(https://omim.org/)中以“epilepsy”为关键词，检索出癫痫的相关靶基因，并与药对中活性成分靶基因进行映射对比筛选出共同靶点，则为药对活性成分治疗癫痫的靶点。

1.5 疾病-活性成分-关键靶点基因网络的构建

利用Cytoscape软件构建疾病-活性成分-关键靶点基因的网络图[10]。网络中各节点(node)分别代表疾病、活性成分和关键靶点基因；网络中边(edge)用来连接疾病与活性成分、活性成分与关键靶点基因；连接到网络的节点以度值(degree)为单位进行表示[11]。某节点与其他节点连接的边数越多，则说明该节点在网络中扮演的角色越重要，度值也越大。通过Cytoscape所构建出来的药物-活性成分-关键靶点基因联系网络图来探索挖掘药对在治疗癫痫时的作用机制。

1.6 关键靶点PPI网络的构建

通过在线检索数据库STRING[12](https://string-db.org/cgi/input.pl)，得到生物系统中相关蛋白质的结构和功能与基因之间的相互作用关系。将关键靶点导入STRING数据库构建出靶点蛋白相关网络，将结果以 TSV 格式导出，再通过Cytoscape获取PPI网络中度值为前10的关键基因(Hub Gene)。靶点蛋白相互作用的网络示意图由多个节点互相衔接而成，而Hub节点与其他节点衔接更为密切。Hub基因对于整个信息结果图的构建必不可少。

1.7 得出GO生物学功能和KEGG通路富集分析

GO生物功能注释是指利用生物信息学功能对基因进行生物功能分析。通过GO富集分析可以获取基因的生物学功能。DAVID是一个专门对基因进行富集分析的工具。方法为将关键靶点基因导入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)，利用在线分析得到靶点基因的GO生物功能注释和KEGG通路富集。

2 结果

2.1 中药复方的收集与筛选

初步检索获取文献425篇，去重后严格按照纳入标准和排除标准上去除294篇文献，最后纳入分析文献131篇，方剂总数226个。226个方剂中共使用221种中药，总的药物使用频次为2 510次。

2.2 运用关联规则获取药对

运用SPSS Modeler中的Apriori进行建模，选取支持度>18，置信度>0.75，前项>6，进行关联分析。所引文献中药物组合的关联规则见图1，表1。其中，置信度最高的且关联性强的药对是陈皮→半夏，在文献中有64个实例，置信度为93.75%，支持度为23.75%。在此次分析规则中，置信度较高的药对，可作为临床上治疗癫痫的常用药对[13]。

2.3 陈皮-半夏所含化学成分的收集与筛选

在TCMSP数据库中，得到陈皮化学成分63个，半夏化学成分116个。设置筛选条件为OB≥30%、DL≥0.18后得到陈皮化学成分5个，半夏化学成分13个，得到目标化合物共18个。18个目标化合物的代码及其相应的口服生物利用度和类药性数值见表2。将收集到的18个目标化合物通过TCMSP库进行检索，得到 268个靶点蛋白，并通过Uniprot数据库将收集到的靶点蛋白名转换为基因名。将这268个靶点导入到 Cytoscape 3.6.0 软件中进行网络构建，得到陈皮-半夏主要活性成分-靶点网络图(见图2)。图2共有 160个节点、267条边，红色代表活性成分，灰色为靶点基因。

图1 关联关系可视图Fig.1 Association relationship view

表1 治疗癫痫处方中药物的关联规则(置信度≥0.75)Table 1 Association rules for drugs in the treatment of epilepsy prescription (confidence≥0.75)

表2 陈皮-半夏活性成分表Table 2 Chenpi-Banxia active ingredient list

2.4 疾病和药物相关靶点的筛选

在Genecards、OMIM中以“epilepsy”为关键词，检索出癫痫的相关靶基因886个，并与陈皮-半夏活性成分的相关靶点基因进行匹配并绘制维恩图。(见图3)图中得到共同靶点41个，说明陈皮和半夏配伍后可能存在协同作用，如参与GABRA1、GABRA5、NR3C2、ADIPOQ、GSK3B等靶点的生物过程。这些基因可能在陈皮-半夏治疗癫痫的过程中发挥一定的作用，为了进一步阐释陈皮-半夏治疗癫痫的作用机制，将这41个靶点作为目标关键靶点进行分析。

2.5 构建与分析网络

用STRING数据库得到41个关键靶点之间的相互作用结果，将结果以TSV格式导出，并在此基础上通过Cytoscape3.7.1获取PPI 网络中图中颜色越深、圆圈越大则得分越高(见图4)及其度值为前10的Hub基因(见图5)。可以看出，这41个靶点间有相互作用，表明这些靶点相互联系，并通过多途径、多方面的协调来起到治疗癫痫的作用，得分前10名的靶点基因依次为 AKT1、MAPK3、FOS、CREB1、CASP3、TP53、JUN、CAT、ESR1、VEGFA，表明这些基因在陈皮-半夏治疗癫痫的过程中具有重要意义。同时，AKT1和其他基因的互相关联程度最高，揭示其可能参与的药理作用最为明显。

图2 陈皮-半夏主要活性成分-靶点网络图 Fig.2 Chenpi-Banxia main active ingredient-target network

2.6 GO生物学功能和KEGG通路富集

将41个关键靶点导入DAVID数据库中，进行GO富集分析。图6显示GO富集分析中存在3个分支，即生物过程(biological process，BP)、细胞组分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)。在生物过程分析中，主要涉及对药物的反应(response to drug，6个靶点)、脂肪细胞分化的正调节(positive regulation of fat cell differentiation，4个靶点)、Ras蛋白信号转导(Ras protein signal transduction，3个靶点)、运动行为(locomotory behavior，4个靶点)以及ERK1和ERK2级联的正调节(positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade，4个靶点)、细胞对药物的反应(cellular response to drug、3个靶点)等。在细胞组分分析中，主要涉及细胞质(cytosol)、细胞连接(cell junction)、突触后膜(postsynaptic membrane)等。在分子功能分析中，主要涉及血清素结合(serotonin binding)、环磷腺苷效应元件结合(cAMP response element binding)、色氨酸结合(chromatin binding)等。表明陈皮-半夏可以通过参与调控多种生物学过程而发挥治疗癫痫的作用。

图3 疾病靶点基因与陈皮-半夏靶点基因匹配图Fig.3 Matching of disease target genes and Chenpi-Banxia target genes

图4 关键靶点PPI网络图Fig.4 PPI network diagram of key targets

图5 关联性强前十种蛋白Fig.5 Related to the top ten proteins

按照KEGG通路富集分析的P-value值排名，得出排名前十的通路(见图7)。KEGG通路富集分析显示，陈皮-半夏的关键靶点主要富集的通路为Serotonergic synapse(hsa04726血清素神经突触信号通路)、Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection(hsa05167卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路)、Hepatitis B(hsa05161乙型肝炎信号通路)、Estrogen signaling pathway(hsa04915雌激素信号通路)、Colorectal cancer(hsa05210结直肠癌信号通路)、TNF signaling pathway(hsa04668TNF信号通路)、Cholinergic synapse(hsa04725胆碱能突触信号通路)、Amphetamine addiction(hsa05031苯丙胺成瘾信号通路)、Relaxin signaling pathway(hsa04926松弛素信号通路)、Dopaminergic synapse(hsa04728多巴胺能突触信号通路)。结果表明，陈皮-半夏的活性成分靶点分布于不同的通路，可通过对各通路协调作用来达到治疗癫痫的目的。

图6 GO富集分析结果Fig.6 GO enrichment analysis results

图7 KEGG富集分析结果图Fig.7 KEGG enrichment analysis results

为了更清晰的展现陈皮-半夏活性成分、核心靶点与通路之间的关系，使用Cytoscape软件构建通路-活性成分-核心靶点网络(图8)。黄色示通路，绿色示活性成分，蓝色示核心靶点。网络图可以直观展示出陈皮-半夏具有通过多成分、 多靶点、多途径相互协调作用于癫痫的特点。

图8 通路-活性成分-核心靶点网络图 Fig.8 Active ingredient-active target-metabolic pathway network

3 讨论

通过Apriori关联规则分析目标数据库里的用药规律得到半夏与陈皮同时配伍治疗癫痫置信度最高。方剂二陈汤[14]以半夏为君燥湿化痰，陈皮为臣理气燥湿化痰，为治疗痰证的通用方。中医对癫痫根据以下六种证型分型治疗，即近期有无发作分为发作期(两型)和休止期(四型)。发作期主要根据发作时病人有无寒热征象分为阳痫和阴痫。休止期有肝火痰热证、脾虚痰盛证、肝肾阴虚证和瘀阻脑络证。阳痫除典型表现外，可伴有明显喉中痰鸣、眩晕、胸闷乏力、舌红苔黄腻脉滑等痰热证的症状。采用主方定痫汤以化痰、清热、开窍、镇惊为主[14]。阴痫则以典型表现外见口吐涎沫却不啼叫，或声音低微，伴有舌淡苔白腻脉沉缓等痰涎内阻证的症状。采用主方以五生饮合二陈汤。其中，定痫汤为治疗癫痫的常用方。方中胆南星为君药“治疗一切风痫”，以半夏、陈皮佐以祛痰。不论阴痫阳痫，发作时均以祛痰为要义。对于休止期的肝火痰热证和脾虚痰盛证也采用祛痰药对半夏和陈皮。明·楼英《医学纲目·癫痫》记载：“癫痫者，痰邪逆上也，……孔窍不通。故耳不闻声，目不识人，而昏眩倒仆也”。朱丹溪《丹溪心法·痫》云：“无非痰涎壅塞，迷闭孔窍。”癫痫病因主要有情志失调、饮食不节等。其中情志方面可因猝然大恐大惊导致气机失调、胆郁不升而引发痰浊内生。饮食方面多过食肥甘、脾胃受损而引起痰浊壅盛。

通过进一步挖掘陈皮与半夏中18个活性成分及其所调控的不同靶点， 推测其可能作用的关键靶点与通路，阐明其协同配伍作用治疗癫痫的机制，体现陈皮-半夏配伍治疗癫痫的多靶点、多通路的特点。关键基因在陈皮-半夏治疗癫痫中具有重要意义，可能为陈皮-半夏药对治疗癫痫的重要靶点。其蛋白产物涉及了细胞凋亡、信号传递、神经调节、炎性过程调节等多个生理生化过程。AKT1(苏氨酸激酶编码蛋白)，在神经系统发育中作为一个关键的调控因子用于调节神经存活。有研究表明，癫痫持续状态时，AKT1蛋白表达呈高峰，发作后期再次呈现高峰状态[15]。VEGFA(血管内皮细胞生长因子)是一种与神经、血管生成均相关的神经营养因子。TP53是一种转录因子，在控制细胞生长和引发细胞调亡方面起着重要作用。CASP3(半胱天冬酶原-3)主要参与细胞凋亡，通过细胞内或外信号，激活CASP3从而发生细胞凋亡反应。JUN(JUN激酶)能够促使MAPK(蛋白激酶)发生信号转导反应，从而调节特定的基因表达来参与细胞凋亡。有研究表明FOS、JUN蛋白做为细胞内第三信使可特异性调节靶基因的表达从而改变癫痫脑神经元的表型表达，有利于癫痫兴奋性易感性长期的形成和维持[16]。

KEGG通路富集分析得到的信号通路大多涉及神经通路与炎症通路。Serotonergic synapse通路在学习记忆、情绪、睡眠、运动、内分泌等生理功能以及包括情绪异常、认知异常在内的病理状态中发挥重要作用。Estrogen signaling pathway通路可调节诸多的生理过程，包括生殖、心血管保护、细胞稳态和行为等，通路中的重要递质为5-HT，5-HT拮抗剂可通过减少过表达的c-Jun调控细胞的周期，阻止神经元凋亡，从而改善癫痫认知功能和自发性发作[17-21]。Hepatitis B通路参与多种功能，并调节转录、细胞信号级联、增殖、分化和凋亡。TNF signaling pathway中的肿瘤坏死因子(TNF)作为一种关键细胞因子，可以诱导广泛的细胞内信号通路，包括细胞凋亡和细胞存活以及炎症和免疫。癫痫发作能够导致炎性细胞因子TNF-α表达上调，可能诱发炎症反应。研究发现，通过电刺激可显著增加TNF-α水平，而大鼠全身应用TNF-α可促进癫痫样放电，癫痫发作和TNF-α之间可能存在相互促进作用[21,22]。乙酰胆碱(ACh)是广泛分布在中枢以及神经系统中的神经递质。在神经系统中，ACh促进了许多功能，例如学习，记忆，注意力和电机控制，癫痫发作时，脑内的ACh释放增加，ACh作用于大脑皮层从而引起神经细胞去极化，出现癫痫放电[23]。

中药具有多成分、多靶点的特点。中药的效应指的是中药有效分子组合对机体生物分子网络进行广泛调节的综合结果，而中药中的某些活性化合物作用于体内，也是通过不同的通路对机体产生作用，从而起到治疗效果。因此通过数据挖掘及网络药理学方法，可得到以中医药理论为基础的“药物-成分-靶点-通路”网络，可全面认识中药治疗疾病的作用机制，为临床治疗提供数据支持。本研究采用数据挖掘和网络药理学方法，从文献中剖析中医治疗癫痫的用药规律，并根据剖析结果提出陈皮-半夏配伍对于癫痫可能存在的作用机制。单纯从数据角度分析存在一定的不足，因此，对于陈皮-半夏治疗癫痫的用药规律及作用机制，还需进一步临床验证，从而更加系统、科学地阐述陈皮-半夏配伍治疗癫痫的作用机制。