隔姜灸天枢穴对UC大鼠结肠组织的miRNA表达谱的影响

顾沐恩，赵继梦，吴焕淦，郑寒丹，刘雅楠，程玲，马喆，吴璐一，李璟，黄艳，杨玲

(1.上海市针灸经络研究所，上海 200030;2.上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院，上海 200437;3.上海市东方医院，上海 200120;4.上海中医药大学针灸免疫效应重点研究室，上海 200030)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性非特异性炎症性肠病，近年来研究认为，遗传、免疫、环境、肠道菌群等是其重要的发病机制[1-4]。随着人们生活方式和饮食结构的改变，UC在中国的发病率有逐年升高的趋势[5-6]，而UC患者因长期而广泛的结肠溃疡、炎症引起的结肠癌变率达3.7%～5.7%[7]，尤其是8年以上的全结肠炎，结肠癌变风险开始逐渐增加[8]。因此，深入研究UC的发病机制，尽早干预UC，预防癌变的发生对临床上UC的诊断和治疗均有重要意义。

近10年来，微小RNA(microRNA，miRNA)在各种疾病中的作用被广泛关注。大量的研究证实了miRNA的功能和潜在价值[9]。相关研究发现，miRNA可调节人类10%～30%的基因表达，在细胞增殖、分化、凋亡、新陈代谢和肿瘤中发挥重要的作用[10]。miRNA为基本的炎症型信号通路的调节方式，可导致不同的炎症性疾病[11]，包括炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)[12-13]。有研究发现，UC疾病中的一些在外周血与结肠组织中功能失调的miRNAs，能通过调节mRNA的表达水平抑制结肠的炎症反应[12]，从而有潜力治疗UC并预防癌前病变[14]。

本研究团队多年研究发现，艾灸可有效改善UC患者的生活质量，减轻肠道炎症反应[15-17]。隔姜灸作为艾灸的1种，因其操作简便、效果显著，亦被广大患者所接受。但隔姜灸对UC的效应机制尚不完全明确，是否可以通过改变UC结肠miRNAs的表达，发挥抑制炎症的作用?因此，本研究采用4% DSS诱导UC大鼠模型，隔姜灸 UC大鼠双侧天枢穴，应用高通量测序的方法，从miRNA的角度研究隔姜灸对UC大鼠结肠miRNA表达谱的影响，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组

30只健康成年Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，体质量(180±20)g，由上海中医药大学实验动物中心提供[购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物使用许可证号SCXK(京)2012-0001]。饲养条件为清洁级，12 h昼夜节律交替(7—19点照明)，室内温度(20±2)℃，室内湿度50%～70%，适应性饲养1周后开始正式实验。实验严格按照美国国立卫生研究院实验动物的使用指南执行，实验过程中对动物的处置遵循科技部颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》规定。将30只大鼠随机分为正常组(NC组)、模型组(UC组)和隔姜灸组(GM组)，每组10只。

1.2 主要设备和试剂

NanoDrop-2000分光光度计(Thermo Fisher Scientific，美国);TapeStation 2200(Agilent Technologies Inc，美国);Illumina HiSeq 2000 测序仪(Illumina，美国);BioRad CFX96TM实时 PCR系统(Bio-Rad Laboratories，CA，USA);葡聚糖硫酸钠(36-50 kDa，#160110，MP Biomedicals，美国);TRIzol Reagent(Thermo Fisher Scientific，美国);Illumina TruSeq小 RNA样品预处理试剂盒(Illumina，美国);Qubit 2.0 Fluorometer using the dsDNA HS and/or BR assay kit(Life Technologies，美国);TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumina，CA，USA);RNase 抑制剂(ThermoFisher Scientific，USA)。

1.3 UC模型建立[18]

UC组和GM组大鼠予以4% DSS自由饮水7 d制备UC大鼠模型。造模后，每组取 2只采用苏木素-伊红(Hematoxylin-eosin，HE)染色观察造模是否成功。造模成功后，UC组和GM组大鼠继续予1% DSS自由饮水7 d以维持肠道炎症。

1.4 艾灸干预

造模成功后，GM组大鼠同时予以隔姜灸干预。取双侧天枢穴。生姜沿纤维纵向切取，切剪成厚0.3 cm、直径1 cm大小的姜片。将艾绒用模具制成直径和高度均为0.6 cm、重约90 mg的艾炷。采用固定器固定大鼠后，暴露双侧天枢穴，提前1 d将天枢穴局部鼠毛剔除，将制成的艾炷放在姜片上，然后将姜片放置于穴位上，点燃艾绒，每次每穴灸2壮。每日1次，共干预7 d。此外，采用与GM组相同的方法对NC组和UC组大鼠进行固定。

1.5 样本采集

隔姜灸干预 7 d后，用 2%戊巴比妥钠(30～40 mg/kg)对各组大鼠进行腹腔注射麻醉，在距离肛门1 cm处采集长6～8 cm的远端结肠。每个结肠分成两部分，一部分用4%多聚甲醛固定用于HE染色;另一部分剪碎后置于冻存管中，用液氮冻存 1 h后保存在-80℃冰箱用于miRNA检测。

1.6 HE染色

每组5只大鼠4%多聚甲醛固定的结肠组织脱水修片后，沿着结肠的肠系膜将结肠垂直石蜡包埋固定，将组织切成 4 μm厚，经二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化，HE染色后脱水、透明、封片，玻片晾干后在低倍镜和高倍镜下观察结肠组织病理形态学变化。

1.7 miRNA的cDNA文库构建、RNA-seq高通量测序和数据分析

每组取 3只超低温冻存的结肠组织采用 Trizol的方法提取总RNA，采用Nanodrop2000检测其纯度和浓度，采用安捷伦 2200检测总 RNA的完整性，将 RIN值大于 8的总 RNA用于文库构建。每个样本取 3 μg总RNA建立miRNA文库，根据Illumina TruSeq Small RNA Sample Prep Kits (Illumina，San Diego，CA)操作说明分别选取不同的index标签建库。建库完成后，利用安捷伦 2200检测文库的质量。本实验采用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS(Illumina)试剂在cBot上生成簇，接着在Hiseq2000测序平台上运行单端测序程序。测序过程由 Illumian提供的 Data collectionsoftware进行控制，实时数据分析。与参考序列比对，采用 DESeq进行分析，计算变化倍数(fold change，FC)和P值，设定 FC≥1.5为上调，FC≤0.5为下调，P＜0.05为差异有统计学意义。

1.8 miRNA靶基因预测及其Pathway通路分析和GO分析

对miRNA进行靶基因预测，使用MIRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)，miRDB(http://mirdb.org/miRDB/)与TargetScan6.2(http://www.targetscan.org/vert_60/)进行联合分析。最后对3个软件的预测结果取其交集。分析靶基因显著富集的 Pathway信号通路，同时进行基因本体(gene ontology，GO)富集分析，P＜0.05 为显著富集。

1.9 统计学方法

采用SPSS22.0统计软件分析，对数据资料进行正态性检验和方差齐性检验，若服从正态分布且方差齐时组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，组间两两比较采用最小显著差法(least significant difference，LSD)进行检验，方差不齐时用Dunnett’s T3法;若资料不服从正态分布，组间比较采用非参数检验，组间两两比较采用Nemenyi法进行。统计检验水准均为α=0.05，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 隔姜灸改善UC大鼠结肠组织病理学损伤

NC组大鼠结肠组织黏膜上皮完整，表面无溃疡，各层组织结构清晰，腺体排列整齐，黏膜、黏膜下层未见充血水肿，无炎性细胞浸润;UC组的大鼠结肠组织黏膜上皮缺失，有较大溃疡面，黏膜层腺体减少，部分腺体形态异常，排列不整齐，有大量的淋巴细胞、浆细胞和中性粒细胞等炎性细胞浸润，充血、水肿明显;与UC组比较，GM组黏膜上皮较完整，少量腺体形态异常，排列欠整齐，黏膜下层可见少量的炎性细胞，未见明显的充血、水肿。详见图1。

图1 各组大鼠结肠组织病理学观察(HE染色，×200)

2.2 DSS诱导的UC结肠组织的差异表达miRNAs

通过测序分析，设定各组间 FC≥1.5为上调miRNAs，FC≤0.5为下调 miRNAs，以P＜0.05为差异有统计学意义。差异表达miRNAs的热图分析可直观地观察每个样本之间的均一性和每组之间的表达差异，热图中可见各组两个样本的表达较为一致，两组之间有明显的差异。与NC组比较，UC组大鼠结肠组织差异表达miRNAs有45个，其中上调的有42个，下调的有3个，其中miRNA表达变化的差异倍数＞3的有4个，即miR-490-5p (FC=3.09)、miR-204-3p(FC=3.04)、miR-3585-3p(FC=14.72)、miR-378b(FC=5.88)。其中miR-3585-3p上调了14.72倍，是上调最大的miRNA。详见图2。

2.3 隔姜灸天枢穴改变UC大鼠的结肠组织中部分差异表达的miRNAs

热图中可见各组 3个样本的表达较为一致，两组之间有明显的差异。与UC组比较，GM组的结肠组织差异表达miRNAs有8个，其中上调3个，下调5个。隔姜灸改变了UC大鼠结肠组织部分miRNAs的异常表达，其中下调的 miRNAs有 3个，即 miR-128-3p、miR-139-5p、miR-204-3p;上调的有5个，即miR-324-5p、miR-20a-5p、miR-17-5p、miR-18a-5p、miR-184。详见图3。

图2 NC组与UC组结肠组织miRNA表达的热图

图3 GM组与NC组结肠组织miRNA表达的热图

图2和图3中有3个共同差异表达的miRNAs，即miR-184、miR-139-5p和 miR-204-3p。其中miR-184在UC模型中下调，隔姜灸干预后上调;miR-139-5p和miR-204-3p在UC模型中上调，隔姜灸干预后下调。详见表1、表2。

表1 UC组与NC组结肠组织miRNA表达

表2 GM组与UC组结肠组织miRNA表达

2.4 隔姜灸逆转UC结肠组织miRNAs靶基因的GO分析

对miR-184、miR-139-5p和miR-204-3p的预测靶基因进行 GO分析的结果显示，参与分子功能(molecular function)的基因有115个，主要涉及蛋白域的特异结合(protein domain specific binding)、磷酸酯水解酶活性(phosphoric ester hydrolase activity)和磷酸酶活性(phosphatase activity)等;参与细胞组成(Cellular Component)的基因有234个，主要涉及细胞骨架部分(cytoskeletal part)，细胞投射部分(cell projection part)，树突(dendrite)等;参与生物过程(Biological Process)的基因有453个，主要涉及有机物质运输(organic substance transport)、神经系统发育(nervous system development)、神经元分化(neuron differentiation)和细胞投射组织(cell projection organization)等。详见图4。

2.5 隔姜灸逆转 UC结肠组织 miRNAs相关靶基因Pathway分析

对miR-184、miR-139-5p和 miR-204-3p的预测靶基因进行KEGG显著富集通路分析的结果显示，主要涉及的通路有25个，主要分为4大类，分别为细胞过程(cellular processes)、环境信息处理(environmental information processing)、人类疾病(human diseases)和有机体系统(organismal systems)。涉及的主要通路有cAMP信号通路、癌症中的蛋白聚糖、癌症中的microRNA、cGMP-PKG信号通路、AMPK信号通路、心肌细胞肾上腺素能信号转导等。详见图5。

图4 miRNAs相关靶基因的GO分析

图5 miRNAs相关靶基因的Pathway分析

3 讨论

溃疡性结肠炎是一种病因尚不十分明确、以结直肠黏膜连续性、弥漫性炎症改变为特点的慢性非特异性肠道炎症性疾病[19]。临床以持续或反复发作的腹泻、黏液脓血便伴腹痛、里急后重为主要表现[20]。UC可发生于任何年龄，青壮年期多见[21]，给患者带来了巨大的精神压力和沉重的经济负担。艾灸作为中医学传统疗法，已被越来越多的患者接受和认可。本课题组多年来研究灸法(温和灸、隔药饼灸和隔姜灸)对炎症性肠病的作用，发现隔药饼灸能改善UC患者腹痛、腹泻及便血的症状，对UC患者疗效确切[15-16，22]。动物实验研究显示，隔药饼灸天枢穴能调节UC大鼠炎症细胞因子、肠道菌群和肠黏膜免疫，抑制肠上皮细胞凋亡，达到修复UC结肠黏膜损伤和减轻炎症反应的作用[23-25]。本课题组也对隔药饼灸和隔姜灸的疗效进行了比较，发现隔药饼灸和隔姜灸天枢穴均是治疗慢性UC的有效方法，两者总体疗效相当[22]，这两种灸法都可以通过调节黏蛋白的表达，起到修复UC大鼠结肠损伤的作用[26]。本研究也发现隔姜灸可以减轻UC大鼠的结肠炎症。但是，目前隔姜灸治疗UC的作用机制研究仍相对较少。

随着基因芯片和高通量测序的发展，miRNA在 UC发生发展中的作用逐渐被揭示，UC疾病相关的miRNAs可调节炎症细胞的趋化、转录因子的活性、肠上皮屏障功能和细胞自噬的活性[27-29]。因此，本课题组从miRNA的角度观察DSS诱导的UC大鼠结肠组织miRNA表达谱的变化及隔姜灸的调节作用，探讨隔姜灸治疗UC的作用机制。结果发现，在DSS诱导的UC大鼠结肠组织中表达改变的miRNAs有45个，其中上调42个，下调 3个。其中的 miR-126、miR-140、miR-214、miR-340、miR-532被早期研究发现在UC及其相关性癌变中有改变，2008年Wu F等[12]首次发现miR-126在活动期 UC结肠组织中表达上调，进一步研究发现miR-126可以通过下调NF-κB信号通路的重要抑制因子IκB的表达促进UC的炎症反应[30];miR-140能作用于其靶基因 HDAC4而克服抗结肠癌药物的耐药性[31]，其在结直肠癌组织中表达上调，并能通过靶向抑制TRAF6的表达减少LPS介导的人结直肠癌细胞的炎性细胞因子TNF-α、IL-6、COX-2的表达[32];miR-214被发现在 UC和结肠炎相关性癌变的结肠组织中表达均明显上调，可通过调节转录因子NF-κB、STAT3的表达促进 IL-6的分泌，激活炎症反应[33];miR-340则在 UC患者外周血血清中表达升高[34];miR-532也与UC免疫炎症反应相关，在活动性和非活动性的UC患者的外周血中表达均上调[35]。因此，上述5个miRNAs可能通过其特定的靶基因，影响炎症因子的表达，从而参与了UC的病理过程，但具体的作用机制以及其余差异表达的miRNAs是否在UC中发挥作用还需进一步的研究。

艾灸可以抑制 UC结肠炎症，发挥免疫调节的作用[36-37]。本课题组前期研究了隔药灸天枢穴对UC大鼠结肠组织miRNA表达谱的影响，发现隔药灸能上调UC中异常表达的miR-184，下调异常表达的miR-490-5p[18]。而在本研究中，隔姜灸能上调UC大鼠结肠中异常表达的 miR-184，下调异常表达的miR-139-5p和miR-204-3p，可见隔药灸和隔姜灸对UC大鼠结肠miRNAs的调控具有共性和特性，这可能与隔物灸所用的间隔物不同有关。课题组重点关注了隔姜灸可调控的3个 miRNAs。已有研究发现 miR-139-5p的缺失可以使小鼠对DSS诱导的结肠炎具有更高的敏感性，并增强肠道肿瘤的形成[38]，miR-139-5p还可以通过抑制NF-κB的活性，调节慢性炎症，抑制结直肠癌细胞的增殖和入侵[39]。miR-204-3p在结肠癌细胞中表达减少，它可以通过靶向 HMGA2抑制结肠癌细胞的生长、迁移和侵袭[40]。以上说明miR-139-5p和miR-204-3p具有抑制结肠炎相关性癌的作用，但它们在UC中的作用尚未见有报道。结合本研究的结果，课题组猜测miR-139-5p和miR-204-3p在结肠炎和结肠炎相关性结肠癌中的表达和作用可能是不同的。由于UC具有较高的发展为结直肠癌的风险[41]，慢性炎症在向肿瘤的发展过程中涉及的机制十分复杂，可能会导致相关分子和物质表达的改变。在炎症过程中，LPS诱导的巨噬细胞中 miR-184的表达也降低[42]，这与本研究中UC炎症条件下miR-184的表达降低是一致的。因此miR-139-5p、miR-204-3p和miR-184可能与UC的发展及艾灸的治疗作用密切相关，但这几个miRNAs在UC中的表达情况以及是如何发挥作用的还有待深入研究。

此外，通过对miR-184、miR-139-5p和miR-204-3p的预测靶基因的GO分析和KEGG富集通路分析，发现涉及的主要通路有cAMP信号通路、癌症中的蛋白聚糖、癌症中的microRNA、Cgmp-PKG信号通路、AMPK信号通路、心肌细胞肾上腺素能信号转导等。综上所述，隔姜灸可能通过调节 UC结肠组织中 miR-139-5p、miR-204-3p和miR-184的异常表达，影响其靶基因的转录，继而调控下游的相关炎症信号通路，减少免疫炎症因子的分泌和释放，起到减轻DSS诱导的UC大鼠肠道炎症的作用。后续将从表观遗传修饰—非编码 RNA介导的基因沉默的角度，结合临床研究、动物实验和体外实验来验证差异表达的 miRNAs，找出其直接调控的靶基因，并明确这些靶基因的功能和作用，这将有助于深入探讨隔姜灸对UC的免疫调节机制。