新型冠状病毒肺炎合并新生隐球菌感染1例报道

蔡金凤， 曹宇硕， 王 棪， 陈海丽， 胡绿荫， 朱召芹

（上海市公共卫生临床中心检验医学科，上海 201508）

新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）是继严重急性呼吸综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（middle east respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）后出现的又一种能引起人严重呼吸系统疾病的新型冠状病毒——严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）感染引发的传染病[1]。COVID-19传染性强、临床表现多样，给疫情防控和疾病治疗带来了一定的困难[2]。

病毒性肺炎合并细菌或真菌感染是导致病情加重的常见原因[3-5]，需要在临床诊治过程中特别注意。新生隐球菌是临床常见的致病性真菌之一，可引起隐球菌性肺炎和脑膜炎等多部位的真菌感染，也是真菌性脑膜炎最常见的致病菌，尤其易导致免疫抑制的宿主感染，特别是获得性免疫缺陷综合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）患者的感染[3]。近年来，随着AIDS、肿瘤化疗和器官移植等患者的增多，隐球菌病的发病率呈上升趋势[6-8]。近期上海市公共卫生临床中心院收治1例COVID-19合并新生隐球菌血流感染患者，现报道如下。

1 临床资料

患者，男性，81岁，既往有“高血压病、冠心病、心功能不全、房颤、肾功不全、肝功能异常”病史。于2020年1月26日出现发热、咳嗽、鼻塞、流涕等症状，外院急诊查血常规示淋巴细胞7.7%、甲型和乙型流感病毒抗原检测均阴性。胸部电子计算机断层扫描（computed tomography，CT）示：两肺散在多发间质性炎症。SARS-CoV-2核酸检测阳性。于2020年1月28日转至上海市公共卫生临床中心治疗。入院完善相关检查，患者患重症肺炎、呼吸衰竭，氧饱和度进行性下降，给予气管内插管呼吸机辅助通气。2020年2月4日病情加重，行气管切开术，2月7日病情进一步加重，行体外膜肺氧合（extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）治疗。

2月24日，实验室回报2月22日送检血培养报阳，报阳血培养样本涂片找到真菌，培养物经鉴定为新生隐球菌。该患者当日血清样本隐球菌抗原检测结果为1∶256。

2 细菌培养

无菌采集患者入院第25天双侧静脉血，分别注入2套厌氧血培养瓶和需氧血培养瓶中，置配套的BACTEX FX 200血培养仪（美国BD公司）内孵育。培养57 h后，其中1瓶需氧血培养瓶报阳，报阳血培养样本分别转种于哥伦比亚血琼脂平板、巧克力琼脂平板和沙保弱琼脂（上海科玛嘉公司），分别置35 ℃、5% CO2及28℃环境下培养，同时进行涂片和革兰染色。涂片镜检可见圆形真菌孢子（图1），疑似隐球菌。从血培养瓶中吸取适量样本于离心管中，加蒸馏水破坏红细胞，1 581×g离心，取沉淀物1滴置于载玻片上，加墨汁1滴，覆盖玻片，在显微镜高倍镜下可见圆形菌体，外有1圈透明的荚膜，内有反光颗粒（图2）。培养24 h后，哥伦比亚血琼脂平板上见灰色、湿润菌落生长；48 h后哥伦比亚血琼脂平板和巧克力琼脂平板上可见灰白色，较大菌落生长（图3）。采用Microflex MALDI-TOF MS质谱鉴定仪（德国布鲁克公司）鉴定为新生隐球菌格鲁比变种，分值为1.793（图4）。血培养的另一需氧瓶5 d未见细菌生长，将瓶中培养物分别转种于哥伦比亚血琼脂平板、巧克力琼脂平板和沙保弱琼脂，分别置35 ℃、5% CO2及28 ℃环境下培养，次日可见灰色、湿润菌落生长，经涂片和革兰染色，镜下可见圆形真菌孢子，质谱鉴定为新生隐球菌格鲁比变种。2瓶厌氧血培养瓶培养5 d无厌氧菌生长。

图1 血培养物革兰染色镜下结果（×1 000）

图2 血培养物去红细胞后墨汁染色镜下结果（×100）

图3 哥伦比亚血琼脂培养24 h菌落生长情况

图4 Micro flex MALDI-TOF MS鉴定结果

综合检查及培养鉴定结果，确认病原菌为新生隐球菌。当日检测该患者血清隐球菌抗原为阳性，滴度为1∶256。随后立即予以伏立康唑抗真菌治疗。2月25日血清隐球菌抗原为阳性，滴度降为1∶128。2月24日再次进行血培养，5 d后需氧血培养瓶和厌氧血培养瓶均为阴性。

3 讨论

新生隐球菌含新生变种和格鲁比变种，广泛分布于自然界，主要侵犯免疫受损的机体，多在机体免疫力低下时引起感染。刘茜等[9]对COVID-19死亡患者尸体解剖大体病理观察的报告提示COVID-19主要引起以深部气道和肺泡损伤为特征的炎性反应。外周血淋巴细胞减少是COVID-19患者的临床特征之一，也是该病确诊的诊断条件之一。本例患者入院时的免疫学指标水平较低，淋巴细胞绝对数0.63×109/L，CD4+T淋巴细胞绝对值为113 cell/uL，CD8+T淋巴细胞绝对值为48 cell/uL，CD4+/CD8+T淋巴细胞比值为3.507，CD19百分比为44%，白细胞介素（interleukin，IL）-6为481.54 pg/mL，IL-10为6.85 pg/mL，符合COVID-19的临床表现。患者降钙素原（procalcitonin，PCT）为1.21 ng/mL，C反应蛋白81.4 mg/L，提示有混合感染的可能。人类免疫缺陷病毒抗体阴性。

新生隐球菌作为一种常见的条件致病菌，易引起免疫功能低下患者感染。本例患者在病程进展中，外周血淋巴细胞计数和CD4+T细胞进行性减低，外周血炎症因子IL-6、PCT、C反应蛋白进行性上升。对该患者的血液样本分别进行二代测序检测，检出人类疱疹病毒5型。以上结果均提示患者存在免疫功能受损，因此容易合并其他机会性感染。本病例提示，COVID-19患者在免疫功能受损的情况下，可以合并包括新生隐球菌在内的机会性感染，进而导致病情恶化，且比较复杂。

实验室诊断过程中，临床样本的处理方法直接影响着检出率的高低，必要时应对临床样本进行离心处理，以提高检出率。酵母菌在需氧瓶中易生长，多数酵母菌2～5 d可被检测出，某些酵母菌如新生隐球菌则需延长孵育时间[10]。本例患者一侧需氧血培养瓶报阳后的鉴定结果为新生隐球菌，另一侧需氧血培养瓶血培养仪培养结果为阴性，故将瓶内培养物继续进行平板培养，以避免遗漏因菌的浓度未达仪器检测阈值而报假阴性的情况发生。另外，我们对报阳血培养样本进行红细胞裂解处理，并行墨汁染色，可以提高显微镜镜检检出率。实验室病原体诊断需要多种方法联合应用。