台州地区结核分枝杆菌分离及耐药特征分析

池宏波， 杨英梅

[1.浙江省台州市台州恩泽医疗中心（集团）恩泽医院检验科，浙江 台州 318000；2.浙江省台州市中心医院 台州学院附属医院检验科，浙江 台州 318000]

结核病是传染病的首要死因，是严重威胁人类健康的公共卫生问题[1]。我国是全球结核病和耐药结核病的高负担国家之一，耐药结核病和耐多药结核病（尤其是利福平和异烟肼双重耐药）发病率和病死率更高，是我国结核病防控和治疗工作面临的一大挑战[2-3]。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的菌种鉴定及耐药性检测对结核病的诊断、治疗和预后起着至关重要的作用。目前，绝对浓度法、比例法检测MTB耐药性耗时长（通常需要4～8 周），不易标准化，而罗氏固体培养法周期长、操作繁琐，均易延误患者的治疗。基因芯片法具有速度快、通量高、灵敏度高、易于标准化等优点，可用于快速筛查耐药结核病。本研究采用DNA微阵列芯片法调查浙江台州地区MTB和非结核分枝杆菌（nontuberculousMycobacterium，NTM）的感染情况，及MTB对利福平和异烟肼的耐药基因特征，以期为该地区结核病（尤其是耐药结核病）的诊断和个体化治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2015年8月—2019年2月恩泽医院3 334例患者的各类临床样本，患者男2 296例、女1 038例，年龄（55±19）岁。临床样本来源包括痰液、穿刺液（胸腹水、脑脊液、心包积液、关节液等）、肺泡灌洗液、脓液或分泌物、尿液、脱落细胞、咽拭子和组织块等。剔除同一患者相同样本类型的同一分离菌株。

1.2 主要仪器与试剂

E x t r a c t o r 3 6 T M核酸快速提取仪、E-CyclerTM 96 PCR仪、BioMixer II芯片杂交仪、SlideWasherTM芯片洗干仪、LuxScanTM10K/B微阵列芯片扫描仪、分枝杆菌核酸检测试剂盒、分枝杆菌菌种鉴定（DNA微阵列芯片法）试剂盒、MTB耐药基因检测试剂盒和HybSet基因微阵列芯片杂交盒均购自北京博奥生物集团有限公司。

1.3 方法

1.3.1 核酸提取 采集研究对象痰液、穿刺液（包括胸腹水、脑脊液、心包积液、关节液等）、肺泡灌洗液、脓液或分泌物、尿液、脱落细胞、咽拭子和组织块等临床样本，采用Extractor36TM核酸快速提取仪，按照分枝杆菌核酸检测标准操作规程进行DNA提取和纯化。

1.3.2 分枝杆菌菌种鉴定 严格按照分枝杆菌菌种鉴定（DNA微阵列芯片法）试剂盒说明书和仪器的标准操作规程进行聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增、芯片杂交、洗涤甩干和扫描结果判读。

1.3.3 MTB耐药基因检测 本研究检测指标包括利福平及异烟肼的3个耐药相关基因——rpoB基因启动子的野生型及不同突变型，其中利福平耐药相关基因rpoB基因检测6个位点，共13种突变型：511位CTG→CCG、513位CAA→CCA、513位CAA→AAA、516位GAC→GTC、516位GAC→TAC、516位GAC→GGC、526位CAC→GAC、526位CAC→TAC、526位CAC→CTC、526位CAC→CGC、 531位TCG→TTG、531位TCG→TGG、533位CTG→CCG。异烟肼耐药相关基因katG基因和inhA基因各检测1个位点，分别为katG基因315位AGC→ACC和AGC→AAC 2个突变型，inhA基因-15位C→T突变型。严格按照MTB耐药基因检测（DNA微阵列芯片法）试剂盒说明书和仪器的标准操作规程进行PCR扩增、芯片杂交、洗涤甩干、扫描结果判读。以芯片自带的阴性、阳性对照作为质控，阳性对照点rpoBIC、katGIC 、inhAIC应为阳性，阴性对照点为阴性则判断实验有效，否则判定该次实验无效。

1.3.4 质量控制 PCR扩增和芯片杂交设立阳性和阴性对照，所有操作均严格按照仪器和试剂盒的标准操作规程进行。

1.4 统计学方法

采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计数资料以例或率表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同类型样本分枝杆菌分离情况

3 334 份送检样本中，检出MTB 837株，总检出阳性率为25.10%；检出NTM 265株，总检出阳性率为7.95%，居前3位的分别为胞内分枝杆菌（4.44%）、浅黄分枝杆菌（1.32%）、鸟分枝杆菌（0.75%）。MTB和NTM的样本来源均以痰液为主，分别占28.33%和9.12%。见表1。

表1 不同类型临床样本分枝杆菌分离情况

2.2 不同性别、年龄患者MTB检出情况

不同性别患者MTB检出率不同，男性MTB检出率为26.88%，高于女性（21.19%）（χ2=12.258，P＜0.05）。不同年龄患者MTB的检出率也不相同（χ2=28.167，P＜0.05），尤其是＜30岁组，MTB检出率（34.29%）显著高于30～59岁组（25.56%，χ2=12.765，P＜0.05）与≥60岁组（22.10%，χ2=28.150，P＜0.05），而30～59岁组与≥60岁组MTB的检出率相近，分别为25.56%和22.10%，差异无统计学意义（χ2=4.734，P＞0.05）。见表2。

表2 不同性别、年龄患者MTB的检出情况

2.3 MTB耐药基因特征分析

从837例MTB感染患者中随机筛选384例进行耐药基因检测，其中对利福平的耐药率为8.33%（32/384），对异烟肼的耐药率为7.03%（27/384），利福平和异烟肼双重耐药率为14.84%（57/384）。89例利福平耐药样本中，rpoB基因耐药位点分布为：511位点占8.99%（8/89），513位点占1.12%（1/89），516位点占8.99%（8/89），526位点占26.97%（24/89），531位点占53.93%（48/89）。84例异烟肼耐药样本中，katG基因315位点占91.67%（77/84），inhA基因-15位点占13.10%（11/84）。

3 讨论

随着我国结核病患者的增多，结核病已逐渐呈现出高感染率、高发病率、高耐药率和高死亡率等特点[4]。掌握结核病的疫情和MTB的耐药情况，对结核病的预防和控制具有重要意义。

本研究3 334份临床样本中，MTB的检出率为25.10%，高于上海地区的平均水平[5]，NTM的感染率为7.95%，明显高于青岛地区（2.86%）[6]，提示台州地区MTB和NTM感染相对较严重，应引起足够的重视。本研究分离的837株MTB和265株NTM的样本来源均以痰液为主，提示呼吸系统对MTB的易感性最强。此外，脱落细胞和咽拭子中均未检出MTB和NTM，可能与样本取材不规范或样本数量过少有关。

本研究结果显示，男性患者MTB的检出率（26.88%）高于女性（21.19%），可能与男性吸烟人数相对较多有关；不同年龄组中，＜30岁组分枝杆菌检出率最高（34.29%），其次为30～59岁组（25.56%）。＜30岁人群检出率最高，可能与该年龄段人群生活压力较大、作息不规律、生活习惯不良等导致其免疫力低下，从而造成的机会性感染有关。因此，应加强该年龄段人群结核病的监测，并及时采取干预措施，特别是该年龄段男性人群结核病的筛检和预防。

利福平与异烟肼是最重要的一线抗结核药物，检测MTB对利福平与异烟肼的敏感性对治疗具有重要的参考价值。本研究通过DNA微阵列芯片法进行MTB对利福平和异烟肼的耐药性检测，发现结核病患者的总耐药率为30.20%，单耐药率为 15.36%，双重耐药率为14.84%，均明显高于贾庆军等[7]报道的杭州市的水平，提示台州地区MTB的临床耐药情况比较严重，应给予足够的重视，严格按照耐药类型和特点，科学制定应对方案，选择有针对性的抗结核药物，有效预防结核病的发生、发展。

有研究结果显示，抗结核药物作用的靶基因或靶基因调控区发生基因突变与MTB耐药高度相关[8]。本研究结果显示，台州地区利福平耐药基因rpoB主要优势突变位点为531位点（53.93%）与526位点（26.97%），异烟肼耐药基因突变位点主要是katG基因315位点（91.67%），与曾方林等[9]的报道一致。

本研究仍有一些不足之处，因只是随机筛选384株MTB进行耐药基因检测，样本量相对较少，结果可能会存在一定偏移。后续研究将进一步扩大样本量，使结果更具有代表性。

综上所述，台州地区的结核病疫情，尤其是耐药结核病疫情较严重。进一步加强患者的早发现、早治疗，加强对结核病患者的耐药监测，并采取有针对性的控制措施，对于结核病的预防和控制意义深远而重大。