异基因造血干细胞移植后细胞免疫重建与真菌感染的相关性

彭新国， 孙长华， 安佳佳， 崔艳芳， 董 艳， 王 健， 高梅兰

（滨州医学院附属医院检验科，山东 滨州 256603）

异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）是实体瘤、恶性血液病、免疫缺陷等疾病的有效治疗手段。allo-HSCT后造血功能恢复较快，多数患者在移植后2～3周即可获得粒细胞和血小板重建，但免疫重建过程却有所延迟[1]。allo-HSCT后的免疫重建分为固有免疫系统的重建和特异性免疫系统的重建。前者包括粒细胞、单核巨噬细胞等，常在移植后2～4周获得重建；后者包括T淋巴细胞和B淋巴细胞，移植后重建非常缓慢，尤其是CD4+T细胞[2]。allo-HSCT患者的免疫重建在防止疾病复发、降低死亡率等方面有重要作用，免疫重建延迟与感染和继发肿瘤等密切相关[3]。侵袭性真菌感染（invasive fungal infection，IFI）是allo-HSCT后患者死亡的主要原因之一，在机体的抗真菌作用机制中，CD4+T细胞介导的特异性免疫应答发挥着关键作用[4]。外周血中初始CD4+T细胞在不同细胞因子的诱导下，可分化为不同亚群的效应T细胞，各自分泌不同的细胞因子，在免疫应答中执行不同功能。为进一步探讨allo-HSCT后CD4+T细胞免疫重建特征及其与IFI的关系，本研究从细胞和细胞因子水平检测不同亚群效应T细胞相关指标的变化。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选取2010年2月—2014年10月滨州医学院附属医院行allo-HSCT的血液恶性肿瘤患者47例，其中男33例、女14例，年龄（38±17）岁；47例患者中，急性髓性白血病34例、急性淋巴细胞白血病8例、慢性髓细胞白血病5例；同胞供者移植38例、无血缘供者移植9例；供受者组织相容性白细胞抗原（histocompatibility leukocyte antigen，HLA） 9/10位点以上相合2例、全相合45例；清髓性预处理方案含抗胸腺细胞球蛋白17例、不含30例；急性移植物抗宿主病预防方案为他克莫司+雷帕霉素+吗替麦考酚酯30例、环孢素+MTX+MMF17例。另选取同期、同院体检健康者40名为对照组，其中男28例、女12例，年龄（38±18）岁。

1.2 方法

1.2.1 移植后免疫细胞亚群数量检测 采用流式细胞术检测移植后免疫细胞亚群数量。采集研究对象清晨空腹外周血5 mL，肝素抗凝，1 000×g离心5 min，取白细胞膜层，采用密度梯度离心法分离单个核细胞层。以适量RPMI 1640培养基+10%胎牛血清+100 U/mL青链霉素重悬单个核细胞，细胞浓度为2×106个/mL。将细胞悬液以每管250 μL的量分装入编号为1、2、3、4、5、6的Eppendorf管中。1、2号管置于37 ℃、5%CO2温箱孵育4～6 h，1 000×g离心5 min，弃上清，行流式细胞术。应用BD Diva软件分析CD4+细胞占淋巴细胞的比例和调节性T细胞占CD4+细胞的比例，并结合外周血淋巴细胞绝对数计算调节性T细胞及CD4+细胞绝对数。3～6号管中加入1 μL佛波酯/离子霉素混液及1 μL布雷菲莱德菌素A/莫能霉素混液，使4个管内终浓度分别为50 ng/mL、1 μg/mL、3 μg/mL及1.4 μg/mL，然后置于37 ℃、5% CO2温箱孵育4～6 h，1 000×g离心5 min，取上清，行流式细胞术。应用BD Diva软件分析辅助性T细胞（helper T cell，Th）17、Th1、Th2占CD4+T细胞的比例，并根据外周血淋巴细胞绝对数计算各亚群细胞的绝对数。所有试剂均购自美国BECKMAN公司，CD4为FITC荧光标记。BD FACSCanto Ⅱ流式细胞仪（4/2系统）购自美国BD公司。

1.2.2 细胞因子浓度检测 采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测细胞因子浓度。采集研究对象清晨空腹外周血5 mL，乙二胺四乙酸抗凝，1 000×g离心5 min，取上清，检测白细胞介素（interleukin，IL）-6、IL-10、干扰素（interferon，IFN）-γ和转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β的浓度。采用美国伯乐公司imark酶标仪进行测定，所有试剂盒均购自美国BioLegend公司，所有操作均严格按照试剂盒说明书要求进行。

1.3 观察指标

观察allo-HSCT后CD4+T细胞免疫重建特征。比较对照者与血液恶性肿瘤患者移植后1、2、3个月的CD4+T细胞、Th17、Th1、Th2、调节性T细胞的数量。观察连续3个月均进行检测的患者的细胞因子水平动态变化，并与对照组进行比较。观察患者移植后IFI发生情况，并分析其与CD4+T细胞免疫重建的相关性。IFI的诊断标准参照《血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌感染的诊断标准与治疗原则（第五次修订版）》[5]。

1.4 统计学方法

采用SAS 9.3软件进行统计分析。正态分布的计量资料以x±s表示，组间比较采用独立样本t检验；非正态分布数据以中位数表示，采用独立样本的Mann-WhitneyU检验；CD4+T细胞免疫重建相关指标与IFI相关性分析采用多因素Logistic回归分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 allo-HSCT后不同时间免疫细胞亚群数量

采用两方差分析对allo-HSCT后不同时间免疫细胞亚群数量进行两两比较。结果显示，移植后1、2和3个月免疫细胞亚群数量均低于对照组（P＜0.05），移植后2、3个月免疫细胞亚群数量均高于移植后1个月（P＜0.05）。见表1。

表1 allo-HSCT后不同时间免疫细胞亚群数量 ×106/L

2.2 allo-HSCT后不同时间细胞因子水平动态变化

移植后1、2和3个月IL-6水平逐渐升高，且与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05），2个月时达到峰值，随后开始降低，但移植后3个月IL-6水平仍高于对照组（t=10.501，P＜0.001）；与对照组比较，移植后1、2和3个月IL-10水平均升高，移植后2个月较1个月降低，3个月回升至最高，移植后2个月与对照组比较差异有显著统计学意义（t=13.530，P＜0.001）；移植后TGF-β水平下降，移植后1、2和3个月各组与对照组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）；移植后不同时间IFN-γ与对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 allo-HSCT后不同时间细胞因子水平 pg/mL

2.3 IFI发生情况及其与CD4+T细胞免疫重建的相关性

参照临床诊疗结果，本研究IFI发生率为19.15%（9/47），其中55.56%（5/9）的病原菌为念珠菌，44.44%（4/9）为曲霉菌；55.56%（5/9）的感染部位为肺部，33.33%（3/9）为口咽部，22.22%（2/9）为肠道（1例患者同时有2个部位发生感染）。

以是否发生IFI为因变量，以CD4+T细胞4个亚群细胞数以及细胞因子IL-6、IL-10、IFN-γ和TGF-β为自变量进行多因素Logistic回归分析，入选标准为0.05，剔除标准为0.1。结果显示，Th17细胞数可能与IFI的发生有关，而Th1、Th2和调节性T细胞数以及IL-6、IL-10、TGF-β和IFN-γ水平与IFI的发生无关。见表3。

3 讨论

allo-HSCT后，因移植方案中应用了大剂量细胞毒性药物及长期免疫抑制药物而影响了免疫重建，患者将经历较长时间的免疫缺陷，从而增加了对病原微生物的易感性[6-7]。IFI是allo-HSCT后常见的严重并发症，即使给予积极的抗真菌治疗，患者仍有较高的发病率与死亡率[8]。但并非所有的患者都会出现IFI，提示存在某些未知因素导致患者对IFI有个体差异，因此明确IFI与CD4+T细胞免疫重建是否具有相关性，对帮助临床制定相应的治疗策略具有重要意义。

allo-HSCT后T细胞重建有2条途径：一条是胸腺依赖性途径，供者来源的前T细胞在胸腺内发育；另一条是胸腺非依赖性途径，即成熟T细胞的外周扩增。前者是移植后T细胞的主要来源，产生初始T细胞，启动缓慢；后者主要是记忆T细胞，能够在抗原与细胞因子的刺激下迅速转变为效应细胞，执行免疫应答，是移植后早期淋巴细胞急剧下降、胸腺功能未恢复时的重要替代途径，在移植后早期的抗感染机制中发挥着重要作用[9-10]。本研究发现，移植后CD4+T细胞及其免疫亚群数量随时间延长而递增，但移植后3个月亚群细胞数仍低于对照组，可能与外周血中的初始CD4+T细胞数量不足有关。即使受到足够的抗原或者细胞因子诱导，在无足够初始CD4+T细胞的情况下，也无法正常活化为各亚群细胞。此外，也可能是由于移植后患者T细胞受体库多态性不足，导致抗原应答能力减弱，向效应T细胞转化的能力减弱及CD4+T细胞亚群重建延迟。

本研究检测了Th1类因子IFN-γ、Th2类因子IL-6和IL-10、调节性T细胞类因子TGF-β，结果显示，TGF-β在移植后3个月内持续低于对照组，而IL-6、IL-10在移植后3个月内持续高于对照组，IFN-γ与对照组比较无差异。这可能是由于上述细胞因子除了来源于CD4+T细胞外，还可由移植后恢复较快的单核巨噬细胞、粒细胞等分泌。这些细胞的活化导致某些细胞因子水平不变甚至升高。

本研究结果显示，IFI可能与Th17细胞数有关，而与Th1、Th2、调节性T细胞数以及IL-6、IL-10、TGF-β、IFN-γ水平无关。此外，Th17是IFI发生的保护因素，提示及时对移植后患者进行Th17检测，可预测患者IFI发生率。但本研究受病例数限制，研究结果尚需进一步扩大样本量加以证实。