真姬菇氨基酸类风味物质超声波提取工艺优化

林铃 张琪辉 马涛

摘 要：为确定真姬菇氨基酸类风味物质的最佳提取条件，以氨基酸态氮提取率为指标，通过单因素试验设计和正交试验设计对真姬菇氨基酸类风味物质超声波提取工艺进行优化研究。单因素试验结果表明：提取温度选择70℃，料水比选择1∶14，提取时间选择45 min时比较适合;正交试验结果表明：影响氨基酸态氮提取率的因素为温度>时间>料水比，温度影响最大，时间次之，料水比影响最小，超声波提取真姬菇氨基酸类风味物质的最佳工艺条件为温度80℃、时间30 min、料水比1∶16，在此最佳工艺条件下氨基酸态氮提取率为（0.915±0.007）mg·g-1。

关键词：真姬菇;超声波;提取工艺;风味物质;氨基酸态氮

Abstract： In order to determine the optimal extraction conditions of amino acid flavor substances in Hypsizygus marmoreus， by using the extraction rate of amino acid nitrogen as the index， the ultrasonic extraction technology of amino acid flavor substances of Hypsizygus marmoreus was optimized by using the single factor experiment and orthogonal experimental design. The results of the single factor experiment showed that the extraction temperature of 70℃， the ratio of material and water of 1∶14， and the extraction time of 45 min were more suitable. The results of the orthogonal experiment showed that the factors affecting the extraction rate of amino acid nitrogen were the temperature>the time>the ratio of material and water， and the temperature had the biggest effect， followed by the time， and the ratio of material and water had the least effect. The optimum technological conditions for the ultrasonic extraction of amino acid flavor substances in Hypsizygus marmoreus were as follows：the temperature was 80℃， the time was 30 min， the ratio of material and water was 1∶16. Under the optimum conditions， the extraction rate of amino acid nitrogen was （0.915±0.007）mg·g-1.

Key words： Hypsizygus marmoreus; Ultrasonic wave; Extraction technology; Flavor substance; Amino acid nitrogen

真姬菇Hypsizigus marmoreus又名斑玉蕈、海鲜菇、蟹味菇等，属于担子菌门、伞菌纲、伞菌目、离褶伞科、玉蕈属[1]，其外形美观、味道鲜美，含有丰富的酚类、维生素E[2]、木质素、血管紧张素转换酶抑制剂[3]、葡聚糖等多糖[4]、氨基酸[5]，具有抗癌、防癌、提高免疫力、预防衰老、延长寿命等多种保健功效，药用价值明显[6]。20世纪80年代以来，真姬菇已在我国商品化种植[7]，现已成为我国食用菌工厂化生产的重要食用菌之一[8]。

根据Najafipour等[9]研究证实，食用菌含有丰富的呈味物质，符合“天然、安全、营养”调味品的发展趋势，是开发天然调味料的热点原料之一。构成食用菌风味物质主要有八碳化合物及其衍生物、萜烯类、含硫化合物以及醛、酸、酮、酯类化合物等[10]呈芳香味的挥发性物质和可溶性单糖及糖醇、游离氨基酸、5′核苷酸及有机酸等[11]呈鲜甜味的非挥发性物质等。真姬菇风味物质中主要氨基酸含量直接反映其营养价值的高低和呈鲜程度，是鲜味提取物质理化指标的重要部分[12]。

目前，真姬菇的提取工艺研究主要有水浸法[13-14]、酶法[15]、微波法[16]及超声波辅助法[17-18]等，而超声波提取真姬菇风味物质的相关研究鲜见报道。本试验以氨基酸态氮提取率为指标，开展真姬菇氨基酸類风味物质超声波提取工艺优化研究，在单因素试验的基础上，以提取温度、提取时间、料水比为主要因素进行正交试验，确定真姬菇氨基酸类风味物质的最佳提取条件，以期为真姬菇风味物质的开发及利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品 真姬菇闽真2号：古田县晟农食用菌农民专业合作社。

1.1.2 主要材料及仪器 硫酸铵、冰醋酸、甲醛、乙酰丙酮、乙酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司产品）;电磁炉（浙江绍兴苏泊尔生活电器有限公司）;T6新世纪紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）;CT50超声波提取器（潍坊市北方制药设备制造有限公司）;DT50多功能提取罐（潍坊市北方制药设备制造有限公司）。

1.2 试验方法

真姬菇氨基酸类风味物质氨基酸态氮的测定参照《GB 5009.235-2016食品安全国家标准食品中氨基酸态氮的测定》第二法。

1.2.1 标准曲线的制备 配置氨氮标准使用液（0.1 g·L-1），准确吸取氨氮标准使用溶液0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL（相当于 NH3N 0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100.0 μg）分别于10 mL比色管中。向各比色管分别加入4 mL乙酸钠乙酸缓冲溶液（pH 4.8）及4 mL显色剂，用水稀释至刻度，混匀。置于100℃水浴中加热15 min，取出，水浴冷却至室温后，移入1 cm 比色皿内，以零管为参比，于波长400 nm 处测量吸光度。每组试验重复3次，取平均值，绘制标准曲线、计算线性回归方程。

按以上试验条件（料水比为X）提取后获得试样，吸取1.0 mL（V1）试样于10 mL（V2）容量瓶中，加水稀释至刻度，混匀。

1.2.2 试样的测定 精密吸取2 mL（V）试样稀释液于10 mL比色管中。加入4 mL乙酸钠乙酸缓冲溶液（pH 4.8） 及4 mL 显色剂，用水稀释至刻度，混匀。置于100℃水浴中加热15 min，取出，水浴冷却至室温后，移入1 cm比色皿内，以零管为参比，于波长400 nm处测量吸光度。试样稀释液吸光度代入線性回归方程，计算试样稀释液含量（m）。

真姬菇氨基酸态氮提取率（mg·g-1）= m/（V×1000×1000×V1/V2）×1000/X

1.2.3 提取真姬菇风味物质的工艺流程 清洗→挑选→切块→称重→调配（按料水比补足水）→超声波提取（置于超声波反应容器中，在固定功率下，一定温度、时间提取）→过滤→测定氨基酸态氮含量。

1.2.4 超声波提取真姬菇氨基酸态氮的单因素试验设计 （1）不同温度对氨基酸态氮提取率的影响。称取2000 g真姬菇（长为2～4 cm），温度为40、50、60、70、80℃，超声波频率26 kHz，功率3000 w，料液比为1∶12，30 min。测定氨基酸态氮提取率，3次重复试验，取平均值。（2）不同料水比对氨基酸态氮提取率的影响。称取2000 g真姬菇（长为2～4 cm），真姬菇与水的比例为1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18，超声波频率26 kHz，功率3000 w，温度70℃，时间30 min。测定氨基酸态氮提取率，3次重复试验，取平均值。（3）不同时间对氨基酸态氮提取率的影响。称取2000 g真姬菇（长为2～4 cm），真姬菇提取时间为15、30、45、60、75 min，超声波频率26 kHz，功率3000 w，70℃，料水比为1∶14。测定氨基酸态氮提取率，3次重复试验，取平均值。

1.2.5 超声波提取真姬菇氨基酸态氮正交试验 根据单因素试验结果，重新选定影响因素的3个水平，以氨基酸态氮提取率为指标，做L9（34）正交试验。因素水平如表1所示，重复试验3次，取平均值。

1.2.6 数据分析 采用WPS Office 2019 11.1.0进行数据处理，运用SPSS Statistics V17.0软件分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 氨基酸态氮标准曲线

以氨基酸氮质量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，如图1所示，在试验范围内，氨基酸态氮质量与吸光值之间呈较良好的线性关系，其线性方程为：y=0.0102x-0.0007，R2=0.9993。

2.2 不同温度对氨基酸态氮提取率的影响

如图2所示，在一定范围内，氨基酸态氮提取率随温度升高而增大，在70℃时氨基酸态氮提取率达到最大值（0.833±0.037） mg·g-1。而温度继续升高，氨基酸态氮提取率开始有所下降，这是因为温度过高时部分氨基酸被破坏或挥发导致。因此，为减少能源消耗，选择提取温度70℃为宜。

2.3 不同料水比对氨基酸态氮提取率的影响

如图3所示，在一定范围内，氨基酸态氮的提取率随料水比降低而增大，料水比为1∶14时，氨基酸态氮提取率达到最大值为（0.863±0.039）mg·g-1，继续降低料水比后氨基酸态氮提取率影响较小。为减少水资源消耗，试验料水比采用1∶14。

2.4 不同提取时间对氨基酸态氮提取率的影响

如图4所示，氨基酸态氮的提取率随时间的增加后略有下降，时间为45 min时提取率最高，为（0.848±0.034）mg·g-1。随着时间的延长，氨基酸态氮提取率并未明显提高。因此，为节省时间，减少能源消耗，提取时间设定为45 min。

2.5 正交试验结果分析

如表2所示，以氨基酸态氮提取率为指标，影响因素依次是A>B>C，即温度>时间>料水比;在试验范围内，最佳超声波提取工艺方案为（A3B1C3），即温度80℃，时间30 min，料水比为1∶16，游离氨基酸态氮提取率为（0.915±0.007）mg·g-1。

3 讨论与结论

超声波提取法通过利用超声波的空化效应、机械效应和热效应原理，加速介质分子运动，增强穿透能力，以此提取有效成分[19]。超声波提取法与热水提取法相比，具有提取温度低、时间短、提取率高等优点[20]。但在试验过程中也应注意，部分问题可能会影响试验结果，如温度计应对准超声波提取罐液面，保证测量温度的准确性;显色剂放置时间不宜过长，容易形成结晶，影响使用;应尽量保证鲜真姬菇的一致性，避免无关变量影响试验结果。

本研究通过单因素分析发现，在一定范围内，升高温度，增加料水比，延长时间，有利于氨基酸的溶出或生成。正交试验优化发现，影响氨基酸态氮提取率的因素为温度>时间>料水比，温度影响最大，时间次之，料水比影响最小，超声波提取真姬菇氨基酸类风味物质的最佳工艺条件为温度80℃、时间30 min、料水比1∶16，在此最佳工艺条件下氨基酸态氮提取率为（0.915±0.007）mg·g-1。目前国内外对真姬菇的研究主要集中在人工栽培和活性成分的鉴定方面[21]，随着真姬菇栽培技术的不断成熟，工厂化生产的真姬菇增产扩量已成为大势所趋。而对真姬菇的深度加工的研究欠缺，影响了产品的进一步开发。本研究探索优化了超声波提取真姬菇氨基酸类风味物质的工艺，对真姬菇深加工具有一定的指导意义。

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（责任编辑：柯文辉）