漆酶/天然介体系统对碱木质素粒径和官能团变化的影响∗

唐雨楠 马尔妮

（北京林业大学材料科学与技术学院，北京 100083）

木质素是自然界中唯一可提供芳环、含量仅次于纤维素的天然高聚物，全球每年生物合成新增量约为6×1014t[1]，具有来源广泛、储量丰富、资源可再生的特点。它包含芳香基、羟基、羰基、甲氧基、羧基、共轭双键等活性官能团，因而可以进行羟甲基化、烷基化和去烷基化、酚化、酰化、酯化、氢解等多种反应[2]，进而有望实现在材料、化学、环境、能源等诸多领域的利用。近年来，在木材研究领域，人们应用木质素作为胶黏剂[3]，一些学者尝试将木质素作为木质材料的改性剂。Gordobil等[4]以酯化木质素浸注木材单板，提升其疏水性和疏油性。Zhou等[5]以工业碱木质素浸注速生材，降低其吸水性、吸湿性，减小尺寸变形。然而相对于木材中的孔隙直径，木质素的粒径较大，不利于深入木材内部。为更好地渗透木材，增强改性效果，需要降解木质素以减小粒径，同时尽量保留活性官能团。

在木质素降解中，常见方法包括酸碱催化水解、醇解、氧化降解、还原降解和热解等[6]。但这些方法所用能耗较大、污染较重，生物降解因其环境友好性而备受关注[7]。同时，生物降解具有底物专一、条件温和、反应效率高、易于控制等优点。生物降解主要依靠微生物所分泌的酶。漆酶是三种经典木质素降解酶之一，以氧气为最终电子受体，还原产物为水，是一种绿色环保的生物催化剂[8]。然而，漆酶氧化还原电势较低，仅能降解木质素中占10%～20%的酚类结构单元[9-10]；另一方面，漆酶单一作用可能导致木质素聚合[9,11-12]。

在漆酶/介体系统的研究中发现，在介体帮助下，漆酶可氧化占木质素80%～90%的非酚类结构单元。同时，介体可抑制木质素的聚合作用，从而实现其全组分的显著降解[13]。相较于合成介体，天然介体来源广、成本低、毒性小、辅助漆酶催化效率高、不易使漆酶失活[14]。Yao等[15]研究表明：漆酶/天然介体系统可实现碱木质素的高效降解和木质素表面酚基的显著富集。

本研究利用漆酶/香草醛天然介体系统处理工业碱木质素，考察木质素的粒径和官能团变化，在此基础上探究漆酶/介体系统处理碱木质素的优化条件，为进一步利用木质素改性木材提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

漆酶（EC1.10.3.2，粉体），购于南京都莱生物技术有限公司；ABTS[2,2'-联氮-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐]，纯度98%，购于上海麦克林生化科技有限公司；香草醛（C8H8O3）和1,4-二氧六环（C4H8O2），分析纯，购于上海麦克林生化科技有限公司；工业碱木质素，由常州山峰化工有限公司提供；柠檬酸、磷酸氢二钠、乙酸和乙酸钠，分析纯，购自北京化工厂。

1.2 设备

电子分析天平，AUX220，日本SHIMADZU公司；电热恒温水浴锅，单列二孔DZKW-D-2，北京市永光明医疗仪器有限公司；紫外-可见分光光度计,U-3900,日本Hitachi公司；多点磁力搅拌器，RO15，德国IKA公司；循环水真空泵，SHZ-III，上海知信实验仪器技术有限公司；电热鼓风干燥箱，101-2AB，天津市泰斯特仪器有限公司；激光粒度分析仪，Mastersizer 2000，英国Malvern Panalytical公司；傅里叶变换红外光谱仪,Nicolet 6700,美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 试验方法

1.3.1 漆酶活性测定

本研究以常用的ABTS法测定漆酶活性[16-17]，参考国际酶学委员会（Enzyme Committee，EC）和其他相关研究的定义[17-18]，将最适条件（pH和温度）下1 min内转化1μmol ABTS的酶量称为漆酶的1 个酶活力单位U，即μmol/min；将每克漆酶所具有的酶活力定义为比酶活U/g。因此，测定所用漆酶的活性前，确定其最适条件，具体方法[18]如下：

分别配制1 mmol/L的ABTS溶液、0.000 2g/mL漆酶溶液和柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液。以1∶1∶3的体积比混合以上三者，作为标准样品。以等体积蒸馏水替代漆酶溶液，作为对照样品。置于水浴中反应，冰浴结束反应，使用分光光度计测定样品在λ=420 nm处的吸光度。

首先，以缓冲液pH为自变量，在40 ℃下反应5 min，选择最适pH。然后，以反应温度为自变量，在pH=4 下反应5 min，选择最适温度。最后，以ABTS溶液浓度为自变量，在最适pH和温度下反应30 min[18]，绘制标准曲线。

根据标准曲线，结合定义可得所用漆酶的比酶活。计算公式[18]如下：

其中，反应液中ABTS自由基浓度c根据标准曲线的线性拟合方程计算得出。

求得的比酶活数据用于木质素处理中的酶量控制，同时便于比较研究。

1.3.2 碱木质素处理

称取一定质量的漆酶于烧杯，按水:漆酶=100 mL:1g的比例加入去离子水[18]，磁力搅拌2 h。称取一定质量的干燥碱木质素置于烧杯中。根据木质素用量，按0.4%（w/w）、25 mL/g、1 mL/g的比例依次加入香草醛、乙酸-乙酸钠缓冲溶液、二氧六环。按对应酶量[（U/g），即漆酶溶液浓度（U/mL）/反应体系中木质素浓度（g/mL）]加入漆酶溶液，开启反应。液面下方通空气以提供漆酶所需氧气，同时实现气流搅拌，反应一定时间。冰浴终止反应，反应液真空抽滤，滤渣置于60 ℃烘箱充分干燥，即得到LMS处理后的碱木质素。

采用单一变量法研究时间、pH、温度、酶量4 个因素对木质素粒径的影响，各因素的对应水平见表1。其中LMS处理后的木质素称为处理组，其他操作一致、仅未添加漆酶得到的木质素称为对照组，未经处理的木质素为未处理组。

表1 各组木质素的反应条件 Tab.1 The reaction parameters of lignin in different groups

1.3.3 粒径分析

使用激光粒度仪检测LMS处理前后木质素的粒径。首先通过超声使木质素在水中充分分散，得到待测样品；然后选择分散剂和样品的折光率分别为1.330 和1.530，控制样品遮光率为10%～20%。之后检测样品在0.02～2 000 μm范围内的粒径分布，同一样品结果恒定后导出。

1.3.4 红外光谱分析

使用红外光谱仪检测处理前后木质素的官能团。将适量样品置于样品台的金刚石ATR附件上，选择分辨率为4 cm-1，每个样品在4 000～400 cm-1的波数范围内扫描32 次。

2 结果与分析

2.1 漆酶活性

试验控制单一变量，分别得到样品吸光度随pH、温度变化的曲线如图1 所示。吸光度值越大，说明被转化的ABTS量越多，即该因素水平下漆酶的活性越高。因此，分别选定漆酶的最适pH为4，最适温度为40 ℃。

图1 ABTS自由基的吸光度曲线Fig.1 The absorbance curves of ABTS radicals

在上述最适条件下实验，绘制得到样品的标准曲线如图2 所示。其中线性拟合方程为：

式中：A——ABTS自由基吸光度；

c——ABTS自由基浓度，mmol/L。

R2=0.980 18，说明拟合程度良好。将最适条件下所得样品的吸光度A=1.40 代入式（2）得到反应液中ABTS自由基浓度，再将相关数据代入式（1），最终求得所用漆酶的比酶活为2 096.3 U/g。

图2 ABTS自由基的吸光度-浓度标准曲线Fig.2 The standard curve of ABTS radicals

2.2 粒径分析

对处理前后碱木质素的粒径大小及分布情况进行分析，不同处理条件下碱木质素的平均粒径如图3 所示。其中，未处理组和对照组的平均粒径分别为5.821μm和9.312 μm。

图3 不同处理条件下碱木质素的粒径Fig.3 The particle sizes of alkali lignin under different treatment parameters

由图3 可知，LMS处理对木质素粒径的总体变化。整体而言，处理组样品的平均粒径全部小于对照组，80%小于未处理组；最小达到4.733 μm，比对照组木质素的平均粒径减小了49.17%，比未处理组减小了18.69%。该结果也在一定程度上说明LMS对木质素具有降解作用，这与以往研究中的结论相一致[19]。

比较同一变量内各梯度对应木质素的粒径结果，发现反应时间为3 h、pH为3.5、温度为35℃、酶量为3U/g的木质素平均粒径最小。由此将以上条件作为漆酶/香草醛介体系统处理碱木质素的优化参数。

考虑到时间、pH两个变量下粒径结果的组间差异较大，说明在本研究选定的梯度下，反应时间和pH是碱木质素粒径降低程度的主要影响因素。

上述试验结果表明：漆酶/香草醛介体系统处理可以减小木质素的粒径。然而，比较未处理组和对照组木质素的平均粒径，发现后者的平均粒径反而增大。由此可见，仅介体处理可能造成木质素的聚合，即LMS中漆酶以外的物质可能导致木质素出现团聚。

通过图4 中二者的粒径分布情况，可以观察到对照组虽然峰底宽与未处理组基本相等，但是相比于未处理组的峰高更低、偏度更大（负偏态）、峰度更小，说明LMS中漆酶之外的物质或试验方法使木质素的粒径分布的集中程度降低，木质素以大颗粒为主。

出现团聚现象可能是因为：抽滤取滤渣的操作无法回收部分可溶于滤液的、降解程度较高的小粒径木质素；常规干燥过程中木质素易出现氢键结合（类似于纤维角质化[20-21]）；反应体系中的介质可能改变木质素的表面性质，使其彼此间易发生静电吸引。

图4 对照组与未处理组木质素的粒径分布比较Fig.4 Particle size distribution of control and untreated lignin

2.3 红外光谱分析

为进一步探讨碱木质素可能出现的化学结构变化，采用红外光谱对木质素处理前后的官能团变化进行检测。由于漆酶不会破坏碱木质素的苯环结构[18,22]，因此选择代表苯环骨架振动的、吸收较为稳定的1 508 cm-1处特征峰作为参照[18,23]，将其他波数下的透过率除以1 508 cm-1处的透过率，得到各处相对于参照峰的透过率并作图。处理组最小粒径木质素与对照组、未处理组木质素经归一化处理的红外光谱结果如图5 所示，碱木质素红外特征峰归属及三组木质素的相对透过率见表2。

图5 处理组最小粒径木质素与对照组、未处理组木质素的红外谱图Fig.5 FT-IR spectra of lignin in treated, control and untreated groups

表2 碱木质素的红外特征峰归属及处理组最小粒径木质素与对照组、未处理组木质素的相对透过率 Tab.2 The FT-IR absorption peak location and assignment of alkali lignin and relative transmittance in treated, control and untreated groups

整体而言，三组木质素的红外吸收谱线十分相似，说明处理前后木质素的官能团种类基本未发生变化，这与其他研究中的结果一致[24-25]。但部分峰的吸收强度有一定差异。在波数3 338 cm-1附近的吸收峰由O—H伸缩振动产生，该峰极宽且钝，吸收较强，说明有较多的分子间或分子内氢键形成。

相比于未处理组，处理组在2 935、2 846 cm-1处的透过率增加，说明—CH3、 —CH2—、—OCH3数量降低。对照组相对于未处理组的变化趋势与处理组相对于未处理组的趋势类似，但对照组在3 338、 2 935、 2 846 cm-1处透过率的增加更为显著，即—OH、 —CH3、—CH2—、—OCH3数量的减少更为剧烈。因此，相较于仅介体处理，LMS处理可以更多地保留—OH、 —OCH3等活性官能团。

3 结论

1）所用漆酶在pH=4、T=40℃的最适条件下与ABTS反应，比酶活为2 096.3 U/g。采用漆酶/香草醛介体系统得到的碱木质素最小平均粒径为4.733 μm，与对照组相比降低49.17%。反应中，时间、pH是主导因素。在本试验条件下确定的优化参数为反应时间3 h、pH3.5、温度35℃、酶量3U/g。漆酶/香草醛介体系统处理可减小木质素粒径，但是仅介体处理可能使木质素发生团聚。

2）漆酶/香草醛介体系统处理后，碱木质素的官能团种类未发生明显改变，但是羟基、甲基、亚甲基、甲氧基等官能团的数量出现变化，LMS处理比仅介体处理更能保留碱木质素的活性官能团。

木质素粒径减小有助于深入木材内部，而保留活性官能团有助于与木材实现良好的结合，该研究结论对于拓宽木质素的应用范围，提高木质素和速生材资源的利用率有一定的参考意义。