ω-氯甲基莰烯的高效快速合成及抑菌活性

霍尚朝, 黄道战, 蓝虹云, 林志楠, 陆于州

(广西民族大学 化学化工学院；广西林产化学与工程重点实验室，广西 南宁 530008)

莰烯是许多植物精油的成分[1]，也是松节油深加工的重要产品[2]，具有抑菌、抗癌、降血脂、驱杀虫等生物活性[3-7]，对农、林、医药行业具有重要的意义。然而，由于其易挥发且亲水性弱(不溶于水)，在实际应用中难以发挥应有的功效。为此，人们对莰烯进行分子结构改造或衍生化[8]，引入或构筑具有协同作用或增强亲水性、生物活性的基团，合成系列深加工产物。其中，利用Prins烯醛缩合反应合成ω-乙酰氧甲基莰烯及其衍生物，包括ω-羟甲基莰烯、ω-酰基莰烯、ω-酰基莰肟醚等[9-11]。ω-氯甲基莰烯是ω-乙酰氧甲基莰烯的衍生物，分子结构中含有莰烯、烯丙基和氯原子，归属于烯丙基氯类化合物。然而，ω-氯甲基莰烯的传统合成方法[12]是以ω-乙酰氧甲基莰烯为原料，采用碱催化水解、PCl3卤代反应的两步化学合成工艺，存在操作工艺复杂、废弃物多、环境污染严重、成本高的问题，限制了ω-氯甲基莰烯的开发利用以及生物活性研究。Yadav等[13]以乙酰氯和无水乙醇作为卤代反应试剂，通过原位生成HCl，实现了室温条件下烯丙醇乙酸酯类化合物的高效转化合成烯丙基氯类化合物。不过，该合成工艺中乙酰氯和无水乙醇的用量较多(n(烯丙醇乙酸酯) ∶n(乙酰氯) ∶n(无水乙醇)高达1 ∶8 ∶8)，成本较高，还易引发副反应。因此，本研究系统考察反应物料比等反应工艺条件对ω-乙酰氧甲基莰烯与乙酰氯和无水乙醇进行卤代反应的影响规律，并对所合成的ω-氯甲基莰烯进行抑菌活性的研究，为其后续开发利用提供基础数据。

1 实 验

1.1 材料、试剂与仪器

莰烯，由广西梧松林化集团有限公司提供，GC含量97%；ω-乙酰氧甲基莰烯，按文献[9]方法由莰烯、多聚甲醛、乙酸制备，GC含量 98%；ω-羟甲基莰烯，按文献[12]方法由ω-乙酰氧甲基莰烯、KOH制备，GC含量97%。大肠杆菌(Escherichiacoli，ATCC-8739)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumonia，ATCC-4352)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC-25923)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，ATCC-6633)、白色念珠菌(Candidaalbicans，ATCC-10231)、热带念珠菌(Candidatropicalis，ATCC-13803)和黑曲霉(Aspergillusniger，ATCC-16404)，北京北纳创联生物技术研究院；水解酪蛋白琼脂(MHA)和马铃薯葡萄糖水(PDB)培养基，北京索莱宝科技有限公司。二甲亚砜(DMSO)、氯仿、无水乙醇、乙酰氯、无水硫酸钠、利福平、酮康唑等，均为市售分析纯。

BXM-30R立式压力蒸汽灭菌锅；全自动智能型生化培养箱，重庆市松朗电子仪器有限公司；ZHJH-C1112B超净工作台；Xevo G2-S QTof型超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱(LC-HRMS)仪，美国 Waters 公司；Magna IR550(Ⅱ)型傅里叶变换红外光谱(FT-IR)仪,美国Nicolet公司；600M核磁共振波谱(NMR)仪，日本电子株式会社；GC-2014C 型气相色谱仪和SE2010型气质联用仪，苏州岛津仪器有限公司。

1.2ω-氯甲基莰烯的制备

图1 ω-氯甲基莰烯的合成Fig.1 Synthesis of ω-chloromethyl camphene

ω-氯甲基莰烯的合成工艺路线如图1所示。称取0.01 molω-乙酰氧甲基莰烯和0.02 mol无水乙醇置于100 mL圆底烧瓶中混合溶解，边搅拌边滴加0.02 mol乙酰氯，然后在30 ℃水浴恒温搅拌条件下反应5 min。反应结束后，减压旋转蒸发除去未反应的乙醇和乙酰氯，向蒸余物加入20 mL蒸馏水分解除去残存的乙酰氯，以10 mL 氯仿萃取3次；有机相合并，用蒸馏水洗至中性，无水硫酸钠干燥、过滤，将滤液蒸发回收溶剂氯仿，得到黄褐色黏稠液体。

1.3 产物的分析

1.3.1气相色谱分析 通过气相色谱仪进行目标产物的含量测定，检测所用色谱柱为DB-5 型石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)，载气为N2，检测器为FID，自动进样器为AOC-20i，进样口和检测器温度均为 200 ℃；升温程序：初温100 ℃，保持 0.5 min，以 5 ℃/min 升温至 180 ℃，保持 1 min。

1.3.2FT-IR分析 通过傅里叶变换红外光谱(FT-IR)仪对目标产物进行红外光谱分析，采用液膜法。

1.3.3LC-HRMS分析 通过超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱(LC-HRMS)仪进行质谱分析，扫描范围m/z50～1000。

1.3.4NMR分析 通过核磁共振波谱(NMR)仪进行1H NMR和13C NMR分析，CDCl3为溶剂，内标为 TMS。

1.4 抑菌活性测试

1.4.1培养基的准备 将2.1 g的MHA培养基和2.6 g的PDB培养基分别置于250 mL三角瓶中，加入100 mL蒸馏水溶解，在121 ℃下灭菌 30 min。

1.4.2样品母液的配制 准确称取0.05 gω-氯甲基莰烯，置于5 mL无菌试管中，加入1 mL DMSO 溶解，配制质量浓度为50 g/L 的溶液。取该溶液20 μL与无菌马铃薯葡萄糖水培养基溶液0.98 mL混合，得到含 DMSO体积分数为2%、质量浓度为1 000 mg/L 的ω-氯甲基莰烯的母液。 同法配制莰烯、ω-乙酰氧甲基莰烯、ω-羟甲基莰烯、利福平(细菌阳性对照品)和酮康唑(真菌阳性对照品)的母液。

1.4.3菌悬液的配制 取适量菌种(4种细菌和3种真菌)分别加入到 10 mL样品瓶中，用无菌水稀释调配成麦氏浊度为0.5的菌悬液，取该菌悬液 50 μL，用相应的无菌培养基稀释1 000倍，配制成初始菌悬液。

1.4.4抑菌活性测试 参考文献[14]，采用微量肉汤二倍稀释法测试。用微量移液器将100 μL含体积分数2% DMSO的无菌培养基溶液加入到96孔平板的2号至12号孔，并将100 μL样品母液分别加入到1号和2号孔。从2号孔取出100 μL样品溶液，加入到3号孔，再从3号孔取100 μL样品溶液加入到4号孔，如此依次在96孔平板上进行2倍稀释操作，最后的稀释操作是从12号孔中取出100 μL溶液丢弃，使1～12号孔中样品溶液质量浓度分别为1 000、 500、 250、 125、 62.5、 31.25、 15.625、 7.812 5、 3.906 3、 1.953 1、 0.976 6、 0.483 3 mg/L。然后，分别向含样品溶液的1～12号孔加注100 μL初始菌悬液，由此，1～12孔中样品溶液的最终质量浓度分别为500、 250、 125、 62.5、 31.25、 15.625、 7.812 5、 3.906 3、 1.953 1、 0.976 6、 0.483 3和0.241 7 mg/L。另将100 μL含体积分数为 2% DMSO的无菌培养基溶液与100 μL初始菌悬液混合，配制成空白对照组。将上述96孔平板置于恒温培养箱培养24 h，其中细菌的培养温度为37 ℃，而真菌的培养温度30 ℃，培养结束后比较测试组与空白对照组样品溶液的浑浊度差异，以不产生浑浊的最低质量浓度作为该样品相应测试菌的最低抑菌浓度(MIC)。每个样品对每种测试菌均做3个平行实验，测试结果取平均值。

2 结果与讨论

2.1ω-氯甲基莰烯的结构分析

ω-氯甲基莰烯，分子式C11H17Cl，黄褐色黏稠液体，得率95.2%；FT-IR(KBr)ν/cm-1：3048，2959，2870，1672，1460，660；1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ: 5.17～5.19 (dd,J=10.1, 5.9 Hz, 1H, H-10), 4.07～4.14 (dd,J=11.0, 8.0 Hz, 2H, H-11), 3.01～3.02 (d,J=4.5 Hz, 1H, H-4), 1.91～1.92 (m, 1H, H-1), 1.63～1.70 (m, 4H, H-5, H-6), 1.16～1.22 (m, 2H, H-7), 1.03 (s, 3H, H-8), 1.01 (s, 3H, H-9);13C NMR (CDCl3，150 MHz )δ: 163.07(C3), 111.93(C10), 47.94(C1), 42.85(C4), 42.38(C11), 41.43(C7), 37.37(C2), 29.01(C8), 28.16(C9), 25.76(C5), 23.78(C6); LC-HRMS([C11H17]+),m/z:149.1330。

以上波谱分析结果表明：ω-乙酰氧甲基莰烯已发生卤代反应，生成了目标化合物ω-氯甲基莰烯。

2.2 工艺条件的优化

2.2.1反应时间 在ω-乙酰氧甲基莰烯0.01 mol 、乙酰氯0.02 mol、 无水乙醇0.02 mol、反应温度为30 ℃条件下，考察了反应时间对目标产物产率的影响，结果如图2(a)所示。由图可知，ω-乙酰氧甲基莰烯可与乙酰氯进行快速的卤代反应，生成ω-氯甲基莰烯，反应时间对转化率的影响不大，而对产率影响较大。反应仅进行5 min，转化率和产率已分别达到97.5%和95.2%；随着反应时间的延长，转化率缓慢增加，但产率逐渐降低，反应进行25 min时，产率降低至65%。采用气质联用仪对反应混合物进行化学组成分析，发现烯丙基醚类化合物的存在，表明ω-乙酰氧甲基莰烯与乙酰氯的卤代反应有副产物烯丙基醚类化合物生成，而且随着反应时间延长，副产物的量增多，产率降低。因此，乙酰氯与ω-乙酰氧甲基莰烯的卤代反应时间宜控制在5 min内完成。

a.反应时间reaction time; b.反应温度reaction temperature;c.乙酰氯用量 dosage of acetyl chloride; d.无水乙醇用量dosage of ethanol

2.2.2反应温度 在ω-乙酰氧甲基莰烯 0.01 mol、乙酰氯0.02 mol、无水乙醇0.02 mol、反应时间为5 min 条件下，考察了反应温度对目标产物产率的影响，结果如图2(b)所示。由图可知，在20～40 ℃温和条件下，乙酰氯与ω-乙酰氧甲基莰烯的卤代反应就能快速进行，反应温度的变化对原料转化率和目标产物产率有一定的影响但影响不大，随反应温度增加，转化率缓慢增加并趋近完全转化。温度由20 ℃升至30 ℃，反应产率由92.5%增加至95.2%，温度高于30 ℃，产率逐渐降低。因此，反应温度选择30 ℃为宜。

2.2.3乙酰氯用量 在ω-乙酰氧甲基莰烯 0.01 mol、无水乙醇0.02 mol、反应温度为30 ℃、反应时间为5 min条件下，考察乙酰氯用量对反应的影响，结果如图2(c)所示。由图可知，乙酰氯用量对反应有很大影响，当乙酰氯用量为 0.01 mol时，反应不完全，反应转化率和产率均小于80%；随着乙酰氯用量增至 0.02 mol，反应转化率和产率逐渐升高到最大值，分别达到97.5% 和95.2%；继续增加用量，反应转化率变化不大，但产率逐渐降低。究其原因，可能是乙酰氯用量较多时，原位生成的HCl过多，反应体系酸性太强，促使产物ω-氯甲基莰烯发生进一步的加成、聚合、异构等副反应。因此，乙酰氯用量选择 0.02 mol为宜。

2.2.4无水乙醇用量 在ω-乙酰氧甲基莰烯 0.01 mol、乙酰氯 0.02 mol、反应温度为30 ℃、反应时间为5 min的条件下，考察无水乙醇用量对反应的影响，结果如图2(d)所示。由图可知，无水乙醇用量对反应的影响较大，当无水乙醇用量小于 0.02 mol，无水乙醇用量不足，反应转化率和产率较低，随着无水乙醇用量增加，反应转化率和产率逐渐提高。当无水乙醇用量大于 0.02 mol时，无水乙醇用量过多，原料转化率和产率逐渐降低。因此，适宜的无水乙醇用量为0.02 mol，转化率和产率分别为97.5%和95.2%。

综合考虑，较佳的反应条件为ω-乙酰氧甲基莰烯 0.01 mol，乙酰氯 0.02 mol，无水乙醇 0.02 mol，反应温度30 ℃，反应时间 5 min。此条件下ω-乙酰氧甲基莰烯转化率为97.5%，ω-氯甲基莰烯产率为95.2%。

2.3ω-氯甲基莰烯的抑菌活性

ω-氯甲基莰烯、ω-乙酰氧甲基莰烯、ω-羟甲基莰烯和莰烯对4种细菌(革兰氏阴性菌：大肠杆菌和肺炎克雷伯菌；革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌)和3种真菌(白色念珠菌、热带念珠菌和黑曲霉)的抑菌活性实验结果列于表1。由表1可知，ω-氯甲基莰烯对供试细菌和真菌的生长均有明显的抑制作用，其抑菌活性明显高于莰烯、ω-乙酰氧甲基莰烯和ω-羟甲基莰烯。其中，ω-氯甲基莰烯对金黄色葡萄球菌的生长抑制作用最强，最低抑菌质量浓度(MIC)达到15.63 mg/L；对3种真菌的生长抑制作用也较强，MIC均为31.25 mg/L；而对其他3种细菌的生长抑制作用稍弱，MIC在62.5～250 mg/L之间。莰烯、ω-乙酰氧甲基莰烯和ω-羟甲基莰烯对细菌和真菌的生长抑制作用较弱，MIC均大于125 mg/L。

表1 ω-氯甲基莰烯对细菌和真菌的抑菌活性1)

1)a.利福平rifampicin; b.酮康唑ketoconazole

与阳性对照品相比较，除白色念珠菌外，ω-氯甲基莰烯对其他供试细菌和真菌的抑制作用均弱于阳性对照品。不过，ω-氯甲基莰烯含有化学活性的烯丙基氯结构，容易通过引入构筑具有协同作用或增强亲水性和生物活性的含氮、氧或硫的功能基，改善其使用性能，拓展其新的应用领域。

3 结 论

3.1以ω-乙酰氧甲基莰烯为原料，乙酰氯和无水乙醇为卤代反应试剂，制得ω-氯甲基莰烯；产物经FT-IR、LC-HRMS、1H NMR和13C NMR的波谱结构表征确证。通过单因素试验得到较佳的合成工艺条件为ω-乙酰氧甲基莰烯0.01 mol、 乙酰氯0.02 mol、 无水乙醇0.02 mol、反应温度30 ℃、反应时间5 min，该条件下ω-乙酰氧甲基莰烯转化率和ω-氯甲基莰烯产率分别高达97.5%和95.2%。

3.2ω-氯甲基莰烯对4种细菌(大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)和3种真菌(白色念珠菌、热带念珠菌、黑曲霉)均有明显的抑制作用，对4种细菌的最低抑菌质量浓度(MIC)依次为 125、 62.5、 15.63、 250 mg/L，对3种真菌的MIC均为 31.25 mg/L，抑菌活性优于莰烯、ω-乙酰氧甲基莰烯和ω-羟甲基莰烯。ω-氯甲基莰烯含有莰烯分子结构和烯丙基氯结构，具有活泼的化学反应活性，易于引入构筑含氮、氧、硫等的生物活性功能基。