角膜内皮移植术后早期玻璃酸钠对泪膜及角膜上皮细胞再生的作用△

彭荣梅 孙彬佳 肖格格 洪晶

角膜移植是治疗角膜盲唯一的方法，也是对角膜和眼表创伤较大的手术之一，术后早期最常见并影响手术效果的并发症是角膜上皮缺损、再生障碍，如果角膜上皮不能快速恢复完整性将影响角膜的透明性和预后，最终导致手术失败[1-2]，因此,如何在角膜移植术后早期尽快恢复角膜上皮和眼表的完整性是术后早期治疗的重点。在最新出台的文献《角膜移植手术用药专家共识》中明确提出角膜移植术后人工泪液的应用是为了润滑角膜、补充泪液、促进角膜上皮的修复，是术后必用药物之一[3]。 玻璃酸钠(sodium hyaluronate,HA)滴眼液作为一种临床常用的人工泪液，对角膜上皮再生有一定的促进作用[4-6]。角膜移植术后应用不同浓度的HA滴眼液对于促进角膜上皮再生作用如何，目前尚未完全清楚。因此,本研究探讨不同浓度HA滴眼液对角膜移植术后早期泪膜和角膜上皮再生的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料本研究为前瞻性病例对照研究。将2017年9月至2018年2月在北京大学第三医院行角膜内皮移植术患者60例(60眼)纳入研究。随机分为1 g·L-1HA组和3 g·L-1HA组，每组各30例。1 g·L-1HA(规格5 mL：5 mg)及3 g·L-1HA(规格5 mL：15 mg)由参天制药株式会社、参天制药(中国)有限公司提供。根据每例患者的用药量进行分配。本研究经北京大学第三医院伦理委员会批准，并告知患者检查目的及检查内容，所有患者均签署知情同意书。

1.2 入选与排除标准入选标准：年龄10～80岁；适合进行角膜内皮移植术；行动自如、配合检查；愿意签署或监护人签署知情同意书并能完成28 d随访。排除标准：有眼部烧伤或严重角膜瘢痕的患者；同时患有眼部感染；联合角膜缘干细胞移植的患者；免疫性眼表疾病的患者。

1.3 治疗方法所有手术均由同一位医师完成,术中所有患者去除直径8 mm范围的角膜上皮。1 g·L-1HA组术后早期治疗方案为1 g·L-1HA滴眼液、左氧氟沙星滴眼液、醋酸泼尼松滴眼液滴眼，均为每天4次，每次1滴，共28 d；术后7 d加用免疫抑制剂10 g·L-1环孢霉素A滴眼液滴眼，每天4次，每次1滴，共21 d；3 g·L-1HA组术后早期治疗方案为3 g·L-1HA滴眼液、左氧氟沙星滴眼液、醋酸泼尼松滴眼液滴眼，均为每天4次，每次1滴，共28 d；术后7 d加用免疫抑制剂10 g·L-1环孢霉素A滴眼液滴眼，每天4次，每次1滴，共21 d。

1.4 检查方法所有患者均于术前、术后1 d、术后3 d、术后7 d、术后14 d、术后28 d进行标准干眼评估问卷(SPEED)及结膜角膜染色评分(OSS)检查；术前及术后7 d、术后14 d、术后28 d进行泪膜破裂时间(TBUT)检查；术后1 d、术后3 d、术后7 d观察角膜上皮缺损范围；术前及术后28 d进行激光共聚焦显微镜检查。相同的检查均由同一位医师进行操作。所有患者均在医师的指导下填写SPEED调查问卷,该问卷包括症状、发生频率及严重程度3组评分。

1.4.1 TBUT检查患者结膜囊滴入荧光素钠，嘱被检查者眨眼数次使荧光素钠均匀分布于眼表，睁开双眼后注视前方，在裂隙灯钴蓝光的照射下，测量由开始睁眼至角膜出现第一个黑斑的时间,即为TBUT，测量3次取平均值。

1.4.2 OSS评分OSS评分标准中将每眼分为鼻侧结膜、颞侧结膜、角膜三部分，其中鼻侧和颞侧结膜按照睑裂区结膜着染点的数量进行评分，评分标准：(1)≤10个着染点为0分；(2)>10～30个着染点为1分；(3)>30～100个着染点为2分；(4)>100个着染点为3分，故结膜最高分为6分。角膜染色根据着染色的数量、形态、分布进行评分，评分标准：(1)无着染点为0分；(2)≥1～5个着染点为1分；(3)≥6～30个着染点为2分；(4)>30个着染点为3分，着染点有融合、着染点位于瞳孔区或出现丝状角膜炎则在上述着染点数量评分基础上各加1分，故角膜最高分为6分。

1.4.3 角膜上皮缺损范围检查采用荧光素钠染色，在记录TBUT后观察角膜荧光素染色范围,记录角膜上皮缺损范围,采用Image J进行缺损范围测量，得出缺损范围的平均直径，单位：mm。

1.4.4 激光共聚焦显微镜检查在术前及术后28 d对患者进行激光共聚焦显微镜检查，由同一位技术人员操作，选取图像清晰的基底细胞层采用仪器所含软件进行细胞计数，计算角膜上皮基底细胞密度。

2 结果

2.1 一般情况1 g·L-1HA组中男9例、女21例，左眼17例，右眼13例，年龄38～80(62.2±12.6)岁；3 g·L-1HA组中男16例、女14例，左眼14例，右眼16例，年龄29～80(61.2±13.6)岁。两组之间性别比例、眼别及年龄差异均无统计学意义(均为P>0.05)，具有可比性。

2.2 SPEED评分各时间点SPPED评分两组之间差异均无统计学意义(均为P>0.05)，见图1。两组组内不同时间点整体比较，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。相邻两个时间点之间两两比较，两组术后1 d SPEED评分显著高于术前(P=0.011)；两组术后3 d与术后1 d SPEED评分差异无统计学意义(P=0.846)；两组术后7 d、术后14 d、术后28 d SPEED评分均低于前一时间点(均为P=0.000)。

图1 两组SPEED评分随时间变化情况

2.3 TBUT检查结果各时间点TBUT两组之间比较：术前TBUT两组之间差异无统计学意义(P>0.05)；术后7 d、术后14 d、术后28 d TBUT 3 g·L-1HA组均显著高于1 g·L-1HA组(均为P<0.05)；见图2。两组组内不同时间点整体比较，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。相邻两个时间点之间两两比较，1 g·L-1HA组后一时间点TBUT较前一时间点均显著延长(均为P<0.05)；而3 g·L-1HA组术后7 d TBUT较术前显著延长(P=0.000)；而两组术后14 d、术后28 d TBUT与前一时间点相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)。

图2 两组TBUT随时间变化情况

2.4 角膜上皮愈合情况各时间点OSS评分两组之间比较：术前、术后1 d、术后3 d两组之间差异均无统计学意义(均为P>0.05)；术后7 d、术后14 d、术后28 d 3 g·L-1HA组OSS评分均显著低于1 g·L-1HA组(均为P<0.05),见图3。两组组内不同时间点整体比较，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。相邻两个时间点之间两两比较，两组术后1 d OSS评分均显著高于术前(P=0.000)；两组术后3 d、术后7 d、术后14 d、术后28 d OSS评分均低于前一时间点(均为P=0.000)。

图3 两组OSS评分随时间变化情况

2.5 角膜上皮缺损范围各时间点角膜上皮缺损范围两组之间比较：术后1 d角膜上皮缺损范围两组之间相比差异无统计学意义(P>0.05)；3 g·L-1HA组术后3 d、术后7 d角膜上皮缺损范围均显著小于1 g·L-1HA组(均为P<0.05)，见图4。两组组内不同时间点整体比较，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。相邻两个时间点之间两两比较，两组术后3 d、术后7 d角膜上皮缺损范围均小于前一时间点(均为P=0.000)。

图4 两组角膜上皮缺损范围随时间变化情况

2.6 角膜上皮基底细胞密度部分患者术前角膜上皮状态差，无法进行角膜上皮基底细胞计数，在该项统计中剔除。图像清晰的患者1 g·L-1HA组有15例，3 g·L-1HA组有14例。对这些数据进行统计学分析。两组之间术前、术后28 d角膜上皮基底细胞密度差异均无统计学意义(均为P>0.05)，见图5。每组组内术前、术后角膜上皮基底细胞密度进行比较：1 g·L-1HA组角膜上皮基底细胞密度术前与术后28 d差异无统计学意义(P=0.576)，而3 g·L-1HA组术后28 d角膜上皮基底细胞密度显著低于术前(P=0.002)。

图5 两组治疗前后角膜上皮基底细胞密度

3 讨论

角膜上皮是眼表重要的屏障，可以抵御病原微生物的侵袭，如果角膜上皮受损，极易造成角膜感染[7]。角膜上皮的完整性对维持眼表稳态有至关重要的作用。角膜上皮状态与术后角膜透明度关系密切。范伟等[8]通过对行LASEK的患者研究发现，角膜上皮缺损面积与术后出现Haze呈正相关。行角膜内皮移植术的患者角膜上皮状态差，术中为了术野清晰可见，常常需要刮除水肿、混浊的角膜上皮，而既往研究也发现角膜内皮移植术后的患者前部角膜Haze发生普遍，并且会影响术后视力[9-10]。因此，角膜内皮移植术患者术后尽快修复角膜上皮十分重要。

HA滴眼液是治疗干眼患者最常用的药物[6]，主要成分为透明质酸钠，是高分子多糖类黏稠性滴眼液，具有高效保水性能，可增加泪膜的稳定性，其糖链能与水形成海绵状结构，延长水分在眼表的时间。本研究使用1 g·L-1HA滴眼液和3 g·L-1HA滴眼液治疗角膜内皮移植术后患者，发现两种滴眼液均可改善患者泪膜状态，3 g·L-1HA组对患者泪膜稳定性的作用明显优于1 g·L-1HA。Lee等[5]对1.8 g·L-1HA组与1.0 g·L-1HA组干眼患者进行随机治疗，证实1.8 g·L-1HA组患者泪膜稳定性更好。Yamaguchi等[11]比较了1 g·L-1HA组和 3 g·L-1HA组对泪膜稳定性改善的作用，发现3 g·L-1HA组能使泪膜更稳定。这些结果均说明泪膜稳定性随HA浓度增加而增加。本研究证实，无论是1 g·L-1HA组还是3 g·L-1HA组，术后各时间点TBUT均长于术前，证实HA均能保持泪膜稳定。3 g·L-1HA组从术后7 d开始TBUT就相对稳定，而1 g·L-1HA组术后14 d及28 d TBUT较前一时间点仍有延长，可能与1 g·L-1HA组患者角膜上皮修复慢于3 g·L-1组有关。

本研究发现，患者术后1 d SPEED评分较术前高，考虑为术后角膜上皮大面积缺损导致。而术后3 d与术后1 d SPEEP评分无明显差别，考虑术后3 d患者角膜上皮仍存在整片缺损，因此患者症状无明显改善。而之后各时间点SPEED评分较前一时间点均有显著改善，考虑与眼表修复有关。但是两组患者SPEED评分在各个时间点无显著性差异，可能原因是手术操作损伤、术后抗排异药物的刺激作用较大，引起眼部不适，该种不适明显大于干眼引起的眼部不适，因此，未能体现不同浓度HA对眼部症状的影响。

本研究观察HA对角膜上皮修复的作用。既往研究中发现，HA通过结合纤维连接蛋白N端的纤维蛋白和肝素结合域促进角膜上皮细胞对纤维连接蛋白的黏附，与纤维连接蛋白协同促进角膜上皮迁移，由此加速角膜上皮的修复愈合，且HA浓度越高，角膜上皮迁移度越大[12]。另外，HA可与CD44结合，促进角膜上皮细胞增殖和半桥粒形成[13]。因此，HA通过促进角膜细胞的迁移、增殖与黏附和半桥粒的形成，加快角膜上皮的损伤修复。本研究发现，3 g·L-1HA组患者角膜上皮缺损愈合、角膜上皮状态明显优于1 g·L-1HA组，证实HA可以促进角膜上皮细胞的修复，并且浓度越大，作用越强，与既往文献报道相符[14]。原因可能是HA浓度越高，与纤维连接蛋白N端的纤维蛋白和肝素结合域结合越多且稳固，与CD44结合，促角膜上皮增殖及半桥粒形成越强，从而使角膜上皮修复更快、更稳定；角膜上皮缺损常导致泪膜不稳定，使得角膜上皮暴露于空气中，不利于角膜上皮的修复，而3 g·L-1HA组患者泪膜更加稳定[11]。本研究结果显示，3 g·L-1HA组在术后7 d TBUT即可达到并稳定在8 s左右，而1 g·L-1HA组泪膜则是逐渐趋于稳定，稳定的泪膜可以更好地润滑和保护眼表，从而辅助角膜上皮修复，形成良性循环；干眼可引发眼表炎症[15]，因此，泪膜稳定可以减轻眼表的炎症，防止炎症对角膜上皮的进一步损伤，促进角膜修复。Fariselli等[16]研究发现，对干眼患者应用HA等可明显改善患者症状、眼表损伤和泪液中细胞因子的水平。Zhong等[17]研究发现，3 g·L-1HA滴眼液可以降低炎症因子水平，增加CD44细胞，证实HA可以通过促进细胞移行、上调修复反应、抑制炎症反应而促进角膜上皮的修复。我们观察了患者术前、术后28 d角膜上皮基底细胞密度，两组之间差异均无统计学意义(均为P>0.05)，但是1 g·L-1HA组角膜上皮基底细胞密度术前与术后28 d差异无统计学意义(P=0.576)，而3 g·L-1HA组术后28 d角膜上皮基底细胞密度显著低于术前(P=0.002)。考虑原因可能如下：(1)样本量有限，导致分析存在偏差；(2)术后修复缺损部位角膜上皮，细胞移行导致密度降低。

综上所述，两种浓度HA均能显著改善角膜内皮移植术后患者主观不适症状，影响泪膜稳定性。3 g·L-1HA滴眼液可以更好地改善角膜内皮移植术后早期泪膜状态，并更快地促进角膜上皮细胞再生。