抑制消减杂交技术筛选骨髓间充质干细胞与视网膜神经节样细胞差异表达基因

牟大鹏 王世瑶 苏冠方

目前，骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经元分化的研究已经取得了一定的进展，BMSCs可诱导分化为视网膜神经节样细胞(RGC样细胞)，并可表达神经细胞的标志物，如神经生长因子(NF)、巢蛋白(nestin)等，在形态上与视网膜神经节细胞(RGC)相似，但凭其就认为BMSCs已转化为RGC，证据尚不充分，需进一步测试其是否具有RGC的一系列功能[1-2]。

因此,了解BMSCs在诱导分化为RGC样细胞后表达的差异基因，筛选出BMSCs向RGC样细胞分化过程中起支配作用的基因，对BMSCs向RGC分化的认证，对其最终分化为功能性RGC，以及利用转基因技术诱导BMSCs向目的细胞分化的应用，均有着不可估量的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器PCR-Select cDNA消减杂交试剂盒、PCR克隆试剂盒均购自美国Clontech 公司，T7、SP6 通用引物、mRNA Purification及pGEM/Teasy 载体均购自美国Promega公司。PCR仪购自美国ABI公司，离心机购自德国Eppendor公司。

1.2 细胞培养原代BMSCs来源于1 周龄 SD大鼠(购于吉林大学实验动物中心)。 SD 大鼠脱颈处死，置于体积分数 75%乙醇中浸泡10 min，无菌条件下取股骨和胫骨，PBS 缓冲液清洗，剪掉股骨及胫骨的骨骺端，露出骨髓腔，以无菌的 L-DMEM/F12培养基冲出骨髓至培养皿内，反复吹打，制成单细胞悬液，离心去除上清液。传代培养至融合状态时(细胞融合率达75%)，用2.5 g·L-1胰蛋白酶1 mL 滴入6孔培养板消化细胞约2 min，并在倒置显微镜下观察，细胞出现边角隆起、收缩、体积变小。在尚未完全脱离板壁时，加入含胎牛血清的培养液中止消化，并用吸管轻轻吹打培养板，使细胞脱壁完全悬浮起来，并按照 13 的比例，将细胞置于培养瓶内，加入5 mL含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM/F12培养液，继续培养。流式细胞术分选CD90+/CD71+阳性的传至第三代的BMSCs。

1.3 视网膜细胞的分离取出生后1～3 d SD乳鼠(购于吉林大学实验动物中心)浸泡于体积分数75%酒精处死。在无菌状态下取出眼球，解剖显微镜下分离出视网膜组织，尽量去除视网膜色素上皮和黏附的玻璃体杂质。采用木瓜蛋白酶37 ℃水浴消化15 min，其间摇动离心管2～3次，待视网膜组织成乳糜状时，加入DMEM培养液吹打数次后再离心，1000 r·min-1离心5 min，收集分选后细胞，低速离心富集。用含体积分数10%胎牛血清的L-DMEM/F12培养基重悬细胞，接种于双层培养板的上层继续培养。

1.4 视网膜细胞与BMSCs共培养传代后的BMSCs按50×103的密度接种于6孔Transwell培养板内的下层，当细胞处于对数生长期时，将视网膜细胞置于双层培养板上面的培养杯内，两种细胞处于分离共培养状态，每隔3 d换培养液和视网膜细胞，每天在倒置相差显微镜下观察细胞的生长及分化情况。

1.5 RNA提取使用Trizol试剂提取BMSCs与诱导后的RGC样细胞总RNA，紫外分光光度计测RNA含量。

1.6 消减文库的构建与筛选提取RGC样细胞总RNA为检测子,BMSCs的总RNA为驱动子，进而由抑制消减杂交方法获得消减杂交产物。SMART PCR cDNA 合成试剂盒合成全长 cDNA ,经RsaⅠ酶消化后，以RGC样细胞的cDNA 作为实验组,以BMSCs cDNA为驱动组(二者比例为 11)，参照 PCR-Selected cDNA合成试剂盒说明书进行消减杂交,进行接头连接效率分析。两轮消减杂交后进行消减杂交产物电泳条带分析，鉴定消减杂交文库质量。将消减杂交产物与pGEM/Teasy载体连接，转化大肠杆菌得到消减文库菌落。经测序,所得基因序列对 NCBI 的NR(NCBI non-redundant protein sequences)和dbEST数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行同源性检索。NR，是NCBI 非冗余蛋白质序列数据库，包括了GenBank 基因的蛋白编码序列。dbEST数据库又称基于表达序列标签数据库，是GenBank的一个子数据库，包含来源于不同物种的表达序列数据和表达序列标签序列的其他信息。

2 结果

2.1 接头连接效率分析接头连接效率分析结果见图1。经灰度扫描，电泳条带间的强度之差小于3倍，说明至少有30%的实验组cDNA连上了相应的接头。

图1 接头连接效率分析 M：DL2000标记物；1和3分别表示连有接头1和接头2R的实验组cDNA； 2和4为G3PDH

2．2 消减杂交效率检测消减杂交效率检测结果见图2，经两轮消减杂交后G3PDH在33个循环后方可扩增出来，而未经消减的对照组则在18个循环时便可见到明显的特异性扩增带，说明经过两轮消减杂交和两次抑制PCR已经使看家基因被有效地消减下去，而差异基因得到了富集。

2.3 抑制性消减杂交回收产物鉴定及TA克隆两轮消减杂交后PCR消减产物电泳条带清晰，见图3。DE81纤维素膜回收纯化经过两次选择性PCR富集的消减产物，纯化产物与载体pEM-Teasy连接，转化大肠杆菌JM109进行文库扩增后共得到一个库容量为120个阳性克隆的消减杂交文库，用巢式PCR 引物 1 和2R进行PCR扩增，鉴定消减杂交文库的质量。电泳检测结果见图4，部分克隆能够扩增出插入片段，插入片段长度主要分布在250～1500 bp，符合实验预期的要求。

图2 PCR检测消减杂交效率 M：DL2000标记物；1～4为未消减后的产物；5～8为消减产物。扩增循环数：1、5：18个；2、6：23个；3、7：28个；4、8：33个

图3 两轮消减杂交后消减产物PCR电泳鉴定 M：DL2000标记物；1：两轮消减杂交后消减产物

图4 抑制性消减杂交回收产物鉴定 M：DL2000 标记物；1～5为消减杂交后的回收产物

2.4 序列测定及计算机分析对以上经PCR鉴定具有插入片段的20个阳性克隆进行测序，所测定的序列用Blast N软件与GenBank公共数据库进行比较，排除重复的片段，共得到5个差异基因片段。阳性克隆与GenBank同源序列比较结果见表1。

表1 阳性克隆与GenBank 同源序列比较结果

GenBank序列号基因名称同源性EST拷贝数NM_017195生长相关蛋白43(GAP43)99%7NM_017214G蛋白信号转导调节因子4(RGS4)100%5NM_031546钙调素100%5NM_053439小G蛋白97%3NM_012631朊蛋白95%1

3 讨论

BMSCs具有良好的成骨、成脂及向神经细胞分化的能力[3]。本研究组先前实验证实，BMSCs可以诱导分化为RGC样细胞[2]。但在BMSCs向RGC样细胞分化的过程中哪些基因起作用，尚未完全清楚。目前大规模比较差异基因的方法还有转录组测序、基因芯片和抑制性消减杂交技术等方法。其中，基因芯片是建立最早也是最为成熟的生物芯片技术,但其只能检测已知序列的特征，且制作成本相对较高[4]。

抑制消减杂交技术是一种高效、快速的筛选差异表达基因的方法，样本量需求少，本研究中标本RNA最低量仅需3 μg，解决了RGC样细胞量不足的问题。由于基因差异表达的变化是调控细胞生命活动过程的核心机制，通过比较同一类细胞在不同生长发育阶段的基因表达差异，可为分析细胞的分化过程提供重要信息。

本研究成功构建了BMSCs向RGC样细胞分化过程中起支配作用的cDNA基因。综合分析发现，这些阳性克隆涉及有丝分裂、视觉信号转导、神经细胞再生等多个方面。GAP43是一种特异性的与神经细胞发育相关的酸性膜磷脂蛋白，参与神经细胞外生长及突触发育形成和神经细胞再生。国际上将 GAP43列为研究神经生长发育和损伤修复等神经可塑性的首选分子探针[5]。该差异基因的检出，提示GAP43可能在BMSCs向RGC样细胞的分化发育和突触形成中起作用。小G蛋白是一种分布于细胞核内的GTP酶，它在调节几种有丝分裂因子的作用中发挥关键作用，并且是基因组稳定性的关键调节剂[6]。因此，我们推测该基因可能与有丝分裂相关，但在诱导分化中的具体作用还需要进一步研究。

RGS是G蛋白信号转导的负调节子。RGS 蛋白可以调节视觉信号转导，RGS蛋白的GAP活性可以使视觉信号的光反应终止[7]。RGS4的检出说明本研究诱导分化后的RGC样细胞可能会产生视觉信号转导的相关基因。钙调素 mRNA在增殖的细胞中的表达增高。钙调素能与Ca2+结合， 具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酶、蛋白丝氨酸和(或)苏氨酸磷酸酶的作用[8]。

朊蛋白(Prion protein) 是一种广泛存在于中枢神经系统及视网膜上的蛋白，近期研究发现在视网膜内外丛状层、RGC层及视网膜神经纤维层可见大量朊蛋白的表达[9-10]。该差异基因的检出说明本研究诱导分化后的RGC样细胞可以产生视网膜神经元相关基因。

本研究直接以BMSCs和RGC样细胞为研究对象，其意义在于快速地分离和筛选BMSCs定向分化的重要基因。其中差异表达基因 GAP43可能与神经细胞外生长及突触发育形成相关，我们推测该基因有可能是BMSCs向RGC样细胞分化过程中起支配作用的基因；此外，差异表达基因朊蛋白在视网膜各层神经元中呈高表达。基于上述研究结果，我们下一步将选择朊蛋白和GAP43作为研究重点，系统研究它们与RGC样细胞分化的关系。