LncRNA SNHG5对高糖缺氧环境下视网膜血管内皮细胞增殖及迁移的影响

陈雅楠 杨堃2 孟旭霞 王一博 杨静

(青岛大学附属医院，山东 青岛 266500 1 眼科； 2 中心实验室)

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病的常见微血管并发症，也是糖尿病患者致盲的最常见原因[1]，视网膜因缺氧导致新生血管形成是其发病的重要因素[2]。研究表明长链非编码RNA(LncRNA)是糖尿病并发症病理过程中的重要调节因子[3-6]。小核仁RNA宿主基因5(SNHG5)是snoRNA U50以及U50宿主基因外显子的成熟剪切体[7-8]。为了探讨SNHG5对视网膜微血管的作用，本研究选用人视网膜血管内皮细胞(HRCECs)建立体外高糖缺氧模型，选用脂质体介导转染SNHG5过表达质粒，观察SNHG5对高糖缺氧诱导的HRCECs凋亡和迁移能力的影响，以期为DR的预防和治疗提供新的切入点。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

HRCECs购自美国ScienCell公司。细胞培养试剂DMEM培养基购自上海中乔新舟生物科技有限公司；胎牛血清、青霉素和链霉素、内皮细胞生长因子、胰蛋白酶及PBS购自美国Gibco公司；葡萄糖购自美国Invitrogen公司。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)主要试剂细胞裂解液、核DNA清除反转录试剂盒、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ试剂盒购自日本TaKaRa公司；RT-qPCR所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。SNHG5过表达型质粒由上海吉凯基因化学技术有限公司设计合成，脂质体LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自上海东仁化学科技有限公司。

1.2 HRCECs的培养及分组处理

HRCECs由液氮罐中取出后置于37 ℃水浴锅中融化复苏，以1 000 r/min离心 3 min后，弃上清液，移入加有5 mL且含体积分数0.10胎牛血清的DMEM混合培养液的培养瓶中。细胞常规培养于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中，隔日换液。当细胞融合度达到90%左右时，按照1∶3的比例传代培养，将HRCECs接种于25 cm2培养瓶中，留取状态良好、处于对数生长期的细胞用于后续实验。

细胞按实验设计随机分为 5组，分别为正常对照组(A组)、高糖组(B组)、高糖缺氧组(C组)、高糖缺氧过表达组(D组)、高糖缺氧空载组(E组)。各组细胞处理如下：① A组：HRCECs接种于含有5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基当中，然后置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱内培养；②B组：HRCECs接种于含有30 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基中，然后置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱内培养；③C组：HRCECs接种于含有30 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基中，并且置于37 ℃、含体积分数0.01 O2的培养箱内培养；④D组：利用脂质体LipofectimineTM2000将其中含有SNHG5目的基因的质粒转染入HRCECs，再将其接种于含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基中，并且置于37 ℃、含体积分数0.01 O2培养箱内培养；⑤E组：利用脂质体LipofectimineTM2000将含有与D组等量的阴性对照质粒转染入HRCECs，将其接种于含30 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基中，并置于37 ℃、含体积分数为0.01 O2培养箱内培养。

1.3 RT-qPCR方法测定细胞中SNHG5基因相对表达量

将HRCECs以105个/孔的密度均匀接种至6孔板中，待细胞贴壁12 h后，更换无血清培养液饥饿培养细胞使其同步化，按上述实验设计分组并处理细胞，每组设3个复孔，培养24 h后收集细胞。取处理后的各组细胞，弃液后胰酶消化，PBS冲洗，使用Trizol试剂分组提取细胞总RNA，以紫外分光光度计测定波长260以及280 nm处的吸光度(A)值，测定总RNA的纯度和浓度。应用去除基因组DNA反应体系，酶解各组实验样本中的DNA，将RNA逆转录为相应的cDNA，并按照TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ试剂盒(TaKaRa，Japan)说明书中要求配置荧光反应体系，在八联管中以cDNA为模板进行PCR扩增，SNHG5上游引物序列：5′-GAGCAGCTCTGAAGATGCAAAGA-3′，下游引物序列：5′-GCTACTCGTCCACACTCAGAACG-3′；内参照为β-actin，β-actin上游引物序列：5′-CGAG-AAGATGACCCAGAT-3′，下游引物序列：5′-GA-TAGCACAGCCTGGATA-3′。定量分析结果以荧光强度(CT值)表示，待检基因表达水平以β-actin作为参比，采用2-△△CT法计算待检基因相对含量，以判定基因上调或下调幅度。

1.4 细胞转染

取对数生长期的细胞制成细胞悬液，以4×105个/孔的密度接种于6孔板中，于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中培养至细胞融合度达到80%左右。稀释脂质体LipofectimineTM2000和质粒并各自孵育5 min后，混合脂质体和质粒，后室温静置20 min，按照LipofectimineTM2000转染试剂使用说明书转染HRCECs，D组转入含有SNHG5目的基因的质粒，E组转入与D组等量的阴性对照体，A～C组不做细胞转染处理。4～6 h后观察细胞状态，更换为新鲜的培养液。转染24～48 h后观察质粒上荧光标记基因的表达情况，待荧光率达80%后补加500 μL正常培养基，于细胞的融合度达到90%时收集细胞。

1.5 Annexin V-FITC/PI双标记染色法检测细胞凋亡情况

取A～E组HRCECs，经胰酶消化后接种于6孔板中，根据实验设计分组并相应处理细胞，将HRCECs培养于不同葡萄糖浓度的培养基中，置于含体积分数0.05 CO2或体积分数0.01 O2的细胞培养箱内进行培养；加入胰蛋白酶终止消化，PBS液冲洗3次，1 000 r/min离心5 min重悬细胞，均匀分成四管，分别标号为1、2、3、4；其中1号管不加任何试剂，2号管加入5 μL Annexin V-FITC，3号管加入5 μL PI，4号管加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI；轻混匀后室温下避光静置反应15 min，加PBS每管补至1 mL后混匀，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况；流式细胞仪测定结果输入计算机，应用分析程序软件进行处理，显示出细胞凋亡百分比。

1.6 细胞划痕实验检测细胞迁移能力

将生长状态良好、处于对数期的HRCECs接种于6孔板中，用无菌200 μL移液枪头垂直于培养板底画“一”字水平划痕，形成一个无细胞区，PBS洗涤2次去除离壁漂浮的细胞，按照实验分组加入不同葡萄糖浓度的DMEM培养液，将6孔板置于不同氧浓度的培养箱中培养，每组细胞设3个复孔，分别于培养后第0、12和36小时在倒置相差显微镜下观察并拍照。用Image J图像分析软件分别测量初始无细胞区面积与当前无细胞区面积，细胞相对迁移面积=(初始无细胞区面积-当前无细胞区面积)/第36小时无细胞区面积×100%。

1.7 统计学方法

2 结 果

2.1 各组HRCECs中SNHG5相对表达量变化

RT-qPCR方法检测结果示，A～E组HRCECs中SNHG5基因的相对的表达量分别为1.006±0.101、0.487±0.474、0.335±0.271、1.609±0.153以及0.985±0.131，差异有统计学意义(F=278.007,P<0.05)。HRCECs中SNHG5的相对表达量B组低于A组(P<0.05)，C组低于B组(P<0.05)，D、E组高于C组(P<0.05)，D组高于E组(P<0.05)，其他任意2组间比较差异均无显著统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组HRCECs凋亡百分比比较

流式细胞仪检测结果显示，A～E组HRCECs的凋亡百分比分别为(2.093±0.146)%、(20.690±1.117)%、(28.683±1.728)%、(14.250±0.276)%和(27.697±0.594)%，差异具有显著统计学意义(F=384.415,P<0.05)。细胞的凋亡百分比B组明显高于A组(P<0.05)，C组高于B组(P<0.05)，D组低于C、E组(P<0.05)，其他任意2组间比较差异无统计学意义。

2.3 各组HRCECs相对迁移面积比较

析因设计的方差分析结果显示，时间、组别及其交互作用均对HRCECs相对迁移面积有明显影响(F组别=252.93,F时间=791.36,F时间*组别=169.89,P<0.05)。单独效应结果显示，随着培养时间的延长，A～E组HRCECs的相对迁移面积均逐渐增大(F=11.64～186.76,P<0.05)；第12和36小时A～E组细胞相对迁移面积比较差异有统计学意义(F=102.28、268.84，P<0.05)。两两比较结果显示，B组细胞在培养后第12和36小时的相对迁移面积均高于A组(P<0.05)，C组高于B组(P<0.05)，D组低于C、E组(P<0.05)，其他任意2组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组细胞各时间点相对迁移面积比较

3 讨 论

随着LncRNA所受的关注越来越多，其在血管生物学中的作用逐渐被学术界所认识[9-14]。研究表明，LncRNASNHG12具有促进氧葡萄糖剥夺/复氧后的脑微血管内皮细胞血管生成以及改善脑微血管内皮细胞损伤的作用[15]。SNHG5在多种人类癌症中表达异常[16-19]，如SNHG5在胃癌、结肠癌等癌症组织中表达下调，并可通过MIR-132-3p途径抑制结肠癌细胞凋亡[20-21]。

本研究以HRCECs为研究对象，为模拟糖尿病患者视网膜内的高糖缺氧环境，将高糖环境培养的HRCECs置于含氧体积分数为0.01的培养箱内，进行体外高糖缺氧环境的培养实验。结果显示，B组SNHG5的表达量低于A组，C组SNHG5的表达量低于B组，表明高糖缺氧培养可以引起HRCECs中SNHG5的表达下调。目前，多项研究结果表明，SNHG5基因在胃癌、脑胶质瘤、肝细胞癌、黑色素瘤等多种恶性肿瘤中具有致癌作用[22-24]。此外，外源性沉默SNHG5基因可促进膀胱癌和结直肠癌细胞凋亡，并抑制相应细胞的增殖能力[25]。本研究将含有SNHG5目的基因的质粒通过脂质体转染进入HRCECs中，RT-qPCR检测结果显示，D组的SNHG5基因表达量明显高于C组，说明通过脂质体转染的HRCECs能够高表达SNHG5。通过流式细胞仪检测细胞凋亡的情况，结果发现，D组HRCECs细胞的凋亡百分比明显低于C组，说明过表达SNHG5基因可以抑制高糖缺氧环境诱导的HRCECs凋亡，从而提示SNHG5对HRCECs的凋亡过程具有调控作用。

研究证实，血管内皮细胞的迁移能力越强，越有利于新生血管的形成[26]。本研究中利用细胞划痕法观察SNHG5对HRCECs迁移能力的影响。结果显示，B组细胞第36小时细胞相对迁移面积高于A组，C组细胞第36小时细胞相对迁移面积高于B组，说明高糖缺氧环境可增加HRCECs的迁移能力；同时发现D组细胞第36小时细胞相对迁移面积低于C组，因此推测在高糖缺氧环境中SNHG5对HRCECs迁移起抑制作用。上述实验结果提示SNHG5可能在抑制糖尿病性新生血管形成的过程中起重要作用。

DAMAS等[18]相关实验研究结果表明，过表达SNHG5可抑制奥沙利铂介导的直肠癌细胞凋亡，同时进一步证实富含丝氨酸精子发生相关蛋白2(SPATS2)是SNHG5重要的直接靶点，同时对细胞增殖具有重要调节作用。下调SNHG5可以破坏SPATS2 mRNA的稳定性，显著降低SPATS2蛋白的表达，而过表达SNHG5可以导致SPATS2 mRNA稳定性以及蛋白表达增加[18]。因此，我们推测SNHG5在HRCECs增殖过程中的调节作用可能通过SPATS2途径实现，但具体的作用机制仍有待进一步的实验加以证实。本实验仅在视网膜血管内皮细胞的层面上进行研究，然而视网膜新生血管形成的通路错综复杂，是多种因子共同作用的结果。我们后期的研究将通过构建体外新生血管模型或采用糖尿病动物模型，进一步探究SNHG5在DR中的调控机制以及具体的信号通路。

综上所述，本研究发现高糖缺氧环境培养可以显著下调HRCECs中SNHG5基因的表达，而过表达SNHG5对HRCECs在高糖缺氧环境下的凋亡和迁移起抑制作用。提示SNHG5在抑制糖尿病性新生血管生成中发挥着重要的正向调节作用。本研究结果为LncRNA在DR预防和治疗中发挥调控作用提供了更多的实验室依据。