TNF-β和IFN-α基因多态性与HPV感染预后的关系研究

石彩歌 黄士荷 张素粉 肖奇志 陈 兴 王群慧 郭天棋

1.广东省珠海市妇幼保健院妇科，广东珠海 519001；2.广东省珠海市妇幼保健院检验科，广东珠海 519001

研究表明，约99%的宫颈癌患者是由人类乳头瘤病毒（HPV）感染所致，这种病毒能够通过密切接触和性接触传播，并且能被人体长期携带[1]。虽然大多数高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是一过性的，可被机体免疫系统清除，但仍有少部分妇女存在高危型HPV 持续感染，进而导致宫颈上皮细胞病变[2-3]。因此，有效的人体免疫体系对清除HPV 感染意义重大。本研究拟将TNF-β 的候选SNP rs909253、rs2239704和IFN-α 的候选SNP rs6475526 多态性作为宫颈病变分子分型指标，为不同分期的宫颈病变自然转归提供基因分型的基础数据，对临床治疗和管理具有一定的指导意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收 集 本 院2018 年1 月～2019 年6 月 高 危型HPV 阳性病例共236 例，年龄22 ～63 岁，平均（42.5±10.3）岁，根据病理确诊CIN 级别分为病理正常组、CIN Ⅰ组、CIN Ⅱ组、CIN Ⅲ组以及宫颈癌组，每组分别45、48、47、50、46 例。纳入标准：（1）所选患者均因白带异常、阴道流血、接触性出血、宫颈炎等症状出现而就诊；（2）所有病例均有性生活史，就诊前一周内未行阴道药物治疗。排除标准：经病理或细胞学确诊为子宫炎症、良性病变、继发肿瘤及病情危重不能清晰回答问题者。以高危型HPV-DNA 检测阴性和病理组织细胞学检测阴性的健康女性为对照组，年龄23 ～60 岁，平均（40.3±8.3）岁，排除妊娠期、宫颈上皮内瘤变病史、肿瘤病史及盆腔放射史，共收集56 例标本。各组一般资料比较差异无统计学意义（P ＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 样本收集 （1）宫颈脱落细胞高危型HPV感染状态的检测按临床常规检测进行：取材自宫颈脱落细胞，细胞保存液4℃保存，一周内检测并记录结果。宫颈组织细胞病理检查按常规送病理科检测，登记检测结果。（2）真空采血管收集病例组及对照组受试者静脉血3mL，采用乙二胺四乙酸（EDTA-K2）抗凝，取其中的200μL，采用全血核酸提取试剂盒提取检测对象外周血基因组DNA，于-20℃冰箱内保存，剩余血液样本冻存于-20℃。

1.2.2 检测方法 （1）高危型HPV-DNA 检测：选择亚能生物技术（深圳）有限公司检测HPV-DNA 23 型试剂盒，按说明书提取DNA，依照程序进程基因扩增，产物变性，并采用全自动杂交仪进行杂交，肉眼观察结果。（2）宫颈组织细胞学检测由临床医生阴道镜下取样，送病理科检测并出具报告。（3）引物设计：针对TNF-β 的候选SNP rs909253、rs2239704 和IFN-a 的 候 选SNP rs6475526，从Genebank 查找SNP 所在人基因组序列，并用prime 5.0 设计扩增和测序引物。由生物公司合成引物。（4）TNF-β、IFN-α 基因候选SNP 检测摸索优化条件应用PCR 方法扩增TNF-β、IFN-α 基因候选SNP 靶片段，采用Sanger 测序法对PCR 产物进行测序，确定SNP 等位基因型。

1.3 统计学处理

数据采用SPSS22.0 统计分析软件进行处理及统计分析，首先检验基因型频率分布是否符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律的要求，基因型和等位基因频数的分布差异采用χ2检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组TNF-β（rs909253）基因型及等位基因频率分布比较

与病理正常组及对照组比较，CIN Ⅰ组、CIN Ⅱ组、CIN Ⅲ组以及宫颈癌组TNF-β（rs909253）基因型分布频率和等位基因分布频率差异有统计学意义（P ＜0.05），见表1 ～ 2。

表1 各组TNF-β（rs909253）基因型频率分布比较[n（%）]

表2 各组TNF-β（rs909253）等位基因频率分布比较[n（%）]

2.2 各组TNF-β（rs2239704）基因型及等位基因频率分布比较

与病理正常组及对照组比较，CIN Ⅰ组、CIN Ⅱ组、CIN Ⅲ组以及宫颈癌组TNF-β（rs2239704）基因型分布频率和等位基因分布频率差异有统计学意义（P ＜0.05），见表3 ～ 4。

表3 各组TNF-β（rs2239704）基因型分布比较[n（%）]

表4 各组TNF-β（rs2239704）等位基因频率分布比较[n（%）]

2.3 各组IFN-α（rs6475526）基因型及等位基因频率分布比较

与病理正常组及对照组比较，CIN Ⅰ组、CIN Ⅱ组、CIN Ⅲ组以及宫颈癌组IFN-a（rs6475526）基因型分布频率和等位基因分布频率差异有统计学意义（P ＜0.05），见表5 ～ 6。

2.4 TNF-β、IFN-α基因与宫颈HPV感染持续及复发的关系

病例组236 例患者中9 例失访，平均随访时间8个月，发现HPV 再次检出率为57.20%（135/236），HPV阴性后再次阳性率为23.70%（32/135），经Kaplan-Meier 法分析并绘制曲线后，随访期间CC、CT、TT基因型的累计HPV 阴性率有明显差异（P ＜0.05），其中CC基因型携带者的HPV感染的累积阴性率最低，且该型携带者的预后更差，复发率更高。

表5 各组IFN-α（rs6475526）基因型频率分布比较[n（%）]

表6 各组IFN-α（rs6475526）等位基因频率分布比较[n（%）]

3 讨论

高危型HPV 持续感染是宫颈上皮内瘤变和宫颈癌的主要病因。宫颈癌给个人、家庭带来极大影响，而宫颈疾病的过度治疗也给社会造成了巨大的经济损失，且这种情况有明显的上升趋势[4]。为加强宫颈高危型HPV 相关疾病的防治工作，国家对于“两癌”的筛查就包括宫颈癌[5]，这将对妇女健康生活质量的提高、社会经济的发展有重要意义。此外，宫颈癌患者临床特征、平均住院日、快速增长的手术费及居高不下的药费是造成高额住院费用的主要因素[6]。因此，控制HPV 感染的转归，对降低宫颈上皮内瘤变进展为宫颈癌、减少宫颈癌发病机会均有较大社会及经济效益[7]。

研究认为[8-9]，HPV 虽是诱发宫颈癌、宫颈上皮内瘤变的重要病原体，但仅有少数的HPV 感染者最终罹患宫颈癌，其余呈HPV 病毒携带状态，部分发展成为宫颈上皮内瘤变，说明HPV 感染后自然结局在个体之间存在着非常大的差异。TNF-β是一种细胞毒性蛋白，主要由活化的T 细胞产生，是细胞免疫的重要因子，同时在先天免疫调节方面也发挥重要作用，能够抑制肿瘤生长和破坏癌细胞[10]。TNF-β 的转录表达也受基因多态性的影响，有研究表明rs909253 和rs2239704 组成的SNPs单倍体可增加非何杰金淋巴瘤发生危险。IFN-α属于Ⅰ型干扰素，是调节免疫系统的一类细胞因子，主要参与先天免疫反应和抗病毒感染， HPV 感染亦与IFN-α 的表达相关。有报道rs6475526 基因多态性与结直肠癌的预后相关[11]，可以作为独立的生物标记物评估风险，国外学者报道认为[12]，在印度女性中TNF-β 基因rs909253 位点多态性与宫颈癌的不良预后相关，并可能是由于CC 基因型关联的TNF-β 基因低表达所导致。与此相对的是在南非女性的研究中rs909253 位点多态性与宫颈癌并无明显关联。其它研究表明仍需要进行更大样本量的前瞻性研究或相匹配的病例对照研究来进一步明确是否IFN-a 基因rs6475526 位点多态性与宫颈HPV 感染风险相关，减少偏倚，并进一步明确IFN-a 基因rs6475526 位点多态性是否与单一亚型的HPV 感染风险相关[13]。通过收集高危型HPV阳性病例，根据病理确诊CIN 级别分为不同组别，与体检HPV 和病理细胞学双阴人员样本进行对照，运用PCR 扩增和Sanger 测序法检测各组基因多态性，结果显示：各组别与对照组比较，rs909253、rs2239704、rs6475526 基因型分布频率和等位基因分布频率存在明显差异。CC 基因型携带者的HPV感染的累积阴性率最低，且该型携带者的预后更差，复发率更高，更容易在高级宫颈疾病组出现。因此，推断TNF-β、IFN-α 基因在HPV 相关子宫颈癌及宫颈病变发生及进展中可能起到一定的作用。TNF-β 基因rs909253、rs2239704 等位基因可能通过影响宫颈局部的免疫状态进而影响了HPV 感染后的转归，导致HPV 感染持续化，细胞和组织进一步向宫颈内瘤样变发展，增加了宫颈癌的危险性。且CC基因型携带者更倾向于HPV 感染的持续和复发[14-15]。持续追踪研究病例，记录宫颈疾病的进行性变化和后续结局，将对本研究有非常有益的补充作用。

综上所述，可将TNF-β、IFN-α 基因多态性作为宫颈病变分子分型指标，尤其是建立TNF-β 的候 选SNP rs909253、rs2239704 和IFN-α 的 候 选SNP rs6475526 的PCR 基因扩增+Sanger（第一代）测序检测方法，能够准确识别并判读SNP 的类型，从而有目的控制HPV 感染的转归，降低宫颈上皮内瘤变进展，为肿瘤的精准预防与控制提供依据。