基于增溶槲皮素的稳定纳米乳的制备

宁远兰， 沈 文， 敖 芬

(陕西科技大学 食品与生物工程学院, 陕西 西安 710021)

0 引言

槲皮素(Quercetin，QT)，又称槲皮黄素，是一种天然黄酮类化合物[1]，具有祛痰止咳、抗氧化、抗肿瘤、清除自由基等药理作用[2,3]，研究发现槲皮素在糖尿病的治疗研究中有明显效果[4].但是，槲皮素的低溶解度(0.17 ～ 7.7μg/ mL)限制了其生物膜透过性，吸收困难，在医药领域的应用受到了限制[5]，主要是因其在体循环中以共轭形式存在[6].药代动力学实验表明[7]，大鼠灌胃给予槲皮素50 mg/kg后的最大血浆浓度Cmax为(2.033±0.410)μg/mL，相较同类药物生物利用度较低.因此需要一种能够提高槲皮素溶解度的高效载体来提高其生物利用度.通过将载体的尺寸减少到微米至纳米级别，如制备成纳米颗粒、聚合物胶束、微乳、水凝胶，能够明显增大这种药物的溶解度[8-13].

相比于上述纳米载体，纳米乳(Nanoemulsion)在研究和药物治疗中引起了极大的关注.纳米乳液呈现透明或半透明状态，相对其他液体制剂具有显著的优势[14]：粒径小且均匀，提高药物的分散度；可轻易穿过细胞间隙，明显提高细胞对药物的摄取率，从而增强药物的靶向性及高效性.按其结构类型划分为O/W型、W/O型和双连续相型三种[15]，作为载体，生物相容性很好，可以减少药物对人体的刺激性和毒副作用[16].有研究[17]制备了粒径为106 nm的槲皮素纳米乳，载药量为0.05%，并将其应用于肺癌的治疗，显示出药物传递的有效性.

因此，本研究通过滴浊法，用Origin8.5软件绘制伪三元相图，筛选出合适的油相、表面活性剂和助表面活性剂，按照一定比例混合均匀，形成O/W型纳米乳.通过染色法确定了纳米乳结构，通过电导率、粘度数据说明了其均匀性，通过加速稳定性试验、Zeta电位研究了纳米乳的稳定性，通过激光粒度表征了纳米乳的乳滴粒径及分布，通过透射电镜表征了其微观形态，分析了影响纳米乳体系稳定性的因素.通过HPLC标准曲线法，考察了稳定纳米乳对难溶性药物槲皮素的增溶作用，载药量为0.15%，起到了明显的增溶作用.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

槲皮素对照品(批号100081-200406)，购自中国药品生物制品检定所；肉豆蔻酸异丙酯(IPM)，购自上海源叶生物科技有限公司；二甲基硅油，购自天津永晟精细化工有限公司；聚氧乙烯40氢化蓖麻油(RH40)，购自巴斯夫股份公司(中国)；乳化剂OP-10、丙三醇，购自天津市富宇精细化工有限公司；试剂纯度均为分析纯；高效液相色谱试剂均为色谱纯；其余试剂均为常规市售试剂.

1.2 仪器与设备

98-II-B型磁力搅拌电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)；NDJ-9S型数显粘度计(上海精密科学仪器有限公司)；Zetasizer NANO-ZS90型纳米粒度分析仪(美国康塔仪器公司)；DDSJ-308A型电导率仪(上海仪电科学仪器股份有限公司)；Tecnai G2 F20型透射电子显微镜(美国FEI公司)；Agilent 1260高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司).

1.3 空白纳米乳组分的筛选

1.3.1 油相的选择

油相应选择对药物溶解度大的无毒无刺激的短链油相，因此待选油相有IPM、乙酸乙酯、二甲基硅油、液体石蜡.根据各油相与表面活性剂、助表面活性剂形成体系外观，选择合适的油相.

1.3.2 表面活性剂的选择

表面活性剂可根据亲水亲油平衡值(HLB值)筛选，一般HLB值为3 ～ 8的乳化剂可制备W/O型纳米乳，HLB值为8 ～ 16的乳化剂可制备O/W型纳米乳.本研究待选表面活性剂有吐温80(HLB=15)、聚氧乙烯40蓖麻油(RH40)(HLB=14 ～ 16)和乳化剂OP-10(HLB=14.5).

将三种表面活性剂与合适的油相，分别按照9∶1～1∶9(质量比)混合均匀，缓慢滴加纯净水，观察体系的澄清度，准确记录相变时水的用量.分别以水相、表面活性剂/助表面活性剂、油相为顶点绘制伪三元相图，根据相图中成乳区域面积的大小确定表面活性剂的种类.

1.3.3 助表面活性剂的选择

助表面活性剂在纳米乳的形成过程中可以协调降低水相、油相的表面张力，增加表面活性剂的溶解度，一般为中链、短链醇.本研究以丙三醇、1,2-丙二醇、无水乙醇作为助表面活性剂，将助表面活性剂与表面活性剂混合均匀；按照不同的质量比，加入到油相中，用纯水滴浊，记录相变时水的体积，绘制伪三元相图，根据成乳区域面积的大小确定助表面活性剂.

1.3.4 表面活性剂和助表面活性剂质量比(Km)的确定

将筛选出的表面活性剂和助表面活性剂与油相以1∶9～9∶1的比例混合，根据伪三元相图中成乳区域面积的大小、乳化颗粒在乳液中的性质、乳化程度及体系稳定性，来确定最佳Km值.

1.4 槲皮素纳米乳的制备

将筛选出的油相、表面活性剂、助表面活性剂和水按照一定比例混合均匀，制备槲皮素纳米乳.

1.5 槲皮素纳米乳的表征

1.5.1 纳米乳结构类型及电导率、稳定性表征

采用染色法进行结构类型鉴别.所用苏丹红III是油溶性染料，在油相中易扩散；亚甲基蓝是水溶性染料，易在水相扩散.根据此性质，如纳米乳中苏丹红III染料的扩散速度大于亚甲基蓝染料，则为W/O型纳米乳；反之，则为O/W型纳米乳.取适量试样，进行电导率、粘度平行组测试，并分别在-3 ℃～0 ℃低温冷冻2 h与12 000 r/min高速离心30 min条件下进行稳定性测试.

1.5.2 形态表征

透射电子显微镜观察纳米乳的微观形态.将适量槲皮素纳米乳稀释10倍后在磁力搅拌器上混匀，使其分散完全.用移液枪吸取20μL待测样品滴加在覆盖碳膜的铜网上，重复操作三次.将处理完成的铜网放在质量分数为2.0 %磷钨酸中负染10 min取出，室温挥干，然后用透射电镜观察其形态.

1.5.3 粒径和Zeta电位

采用纳米粒度分析仪测定平均粒径及Zeta电位；取适量槲皮素纳米乳，稀释10倍后，用纳米粒度分析仪测定平均粒径及Zeta电位，记录平均粒径、多分散指数(PDI)、Zeta电位及其分布图.

1.5.4 纳米乳对槲皮素增溶能力的测试

室温条件下，将槲皮素分别溶于纯净水和空白纳米乳中，采用高效液相色谱法(HPLC)测定，以槲皮素对照品溶液浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，制作标准曲线，测定含量.

2 结果与讨论

2.1 空白纳米乳组分的筛选

2.1.1 油相的选择

三种油相形成的混合体系外观如图1所示.当油相为液体石蜡、二甲基硅油时，整个混合体系十分不稳定，放置10 min即出现分层现象.随着水量的增加，体系流动性逐渐增大，颜色为乳白色；油相为IPM时，混合体系呈现透明状态，但是有游离油滴存在，放置1 h后同样出现分层现象；油相为乙酸乙酯时，混合体系呈完全透明状态，符合纳米乳外观评定标准，本研究方案选用乙酸乙酯作为油相.

a:乙酸乙酯；b:IPM；c:液体石蜡；d:二甲基硅油图1 不同油相形成纳米乳的外观

2.1.2 表面活性剂的选择

表面活性剂能够显著降低界面张力形成界面膜保持纳米乳的稳定性，其选择需考虑安全经济等问题[18]，伪三元相图法中成乳区域的面积越大，表明乳化效果越好，形成的纳米乳就越稳定[19].由预实验可知乙酸乙酯与吐温80、RH40和乳化剂OP-10在一定比例范围内均可形成澄清透明的纳米乳.如图2所示，在三种表面活性剂绘制的伪三元相图中，乳化剂OP-10形成纳米乳区域的面积最大，这是由于乳化剂OP-10的加入使得混合体系中油相和水相之间的界面张力得到平衡，表现出良好的稳定性.因此，选用乳化剂OP-10作为表面活性剂.

(a)乳化剂OP-10 (b)RH40

(c)吐温80图2 不同表面活性剂对纳米乳成乳区域面积的影响

2.1.3 助表面活性剂的选择

选择丙三醇、1,2-丙二醇、无水乙醇作为助表面活性剂.在室温条件下，将乙酸乙酯、三种助表面活性剂与乳化剂OP-10按照不同的质量比混合均匀，滴加纯净水，记录体系相变时所需水量.同法绘制伪三元相图，根据成乳区域面积的大小确定助表面活性剂的种类.由图3得知，助表面活性剂为1,2-丙二醇时，形成的纳米乳区域面积明显小于丙三醇和无水乙醇，丙三醇和无水乙醇成乳面积大小肉眼观察差别不大，因此利用曲线拟合计算面积，发现丙三醇作为助表面活性剂成乳区域面积大于无水乙醇作为助表面活性剂的面积.但是由于丙三醇的粘度远高于无水乙醇，不易调节纳米乳体系中油相、水相的相互作用力.此外，无水乙醇具有较强的剪切力[20]，使得体系中的油相分子被切割成直径更小的粒子，油相在水中的分散度增加，纳米乳更加稳定.且槲皮素在无水乙醇中的溶解度要远高于丙三醇，因此，选用无水乙醇作为助表面活性剂.

(a)1,2-丙二醇 (b)丙三醇

(c)无水乙醇图3 不同助表面活性剂对纳米乳成乳区域面积的影响

2.1.4 表面活性剂和助表面活性剂质量比(Km)的确定

根据上述筛选实验的结果，选择乙酸乙酯为油相，乳化剂OP-10为表面活性剂，无水乙醇为助表面活性剂，设定两者质量比(Km)为1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1，结果如图4所示，当Km为1∶2、1∶1、3∶1、4∶1时成乳区域面积较小；当乳化剂OP-10与无水乙醇的质量为2∶1时，混合乳化剂的HLB值与油相最接近，伪三元相图乳化区域面积最大，随着表面活性剂用量的增加，纳米乳更易形成，且粒径更小，体系也更加稳定，因此确定Km为2∶1.

由2.1.1～2.1.4确定空白纳米乳的组成为：乙酸乙酯/乳化剂OP-10/无水乙醇/纯净水，混合体系中混合表面活性剂与油相质量比为6∶4，Km为2∶1.

精密称取0.6 g乳化剂OP-10与0.3 g无水乙醇均匀搅拌，加入0.6 g乙酸乙酯和0.01 g槲皮素，继续搅拌并滴加纯净水，形成澄清稳定乳液，蒸馏水用量为5.05 mL.制备得到槲皮素纳米乳.

(a)Km：1∶2 (b)Km：1∶1

(c)Km：2∶1 (d)Km：3∶1

(e)Km：4∶1图4 不同Km值对纳米乳成乳区域面积的影响

2.2 槲皮素纳米乳的表征

2.2.1 外观及结构类型鉴定

本研究制备的槲皮素纳米乳呈现浅黄色、均一澄清透明状态，激光照射下出现丁达尔效应.结构类型鉴别结果显示，纳米乳中亚甲基蓝染料的扩散速度大于苏丹红III染料，表明本研究制备的槲皮素纳米乳为O/W型.

2.2.2 电导率、粘度及稳定性测定

用电导率仪测定槲皮素纳米乳电导率，在同一样品中平行测量三次.结果显示平均电导率为99.0μs/cm，结果如表1所示.

表1 槲皮素纳米乳的电导率

电导率结果显示槲皮素纳米乳具有均一稳定的电化学特征，导电能力强，说明其结构具有等量的内极化能力.取槲皮素纳米乳适量，用数显粘度计测定其粘度，平行测量三次.结果显示平均粘度为0.024 Pa·s，结果如表2所示.

表2 槲皮素纳米乳的粘度

粘度测试结果表明，所制备的槲皮素纳米乳属于典型的牛顿流体，其流体内部质点符合牛顿运动定律，分子热运动定律.电导率与粘度检测结果说明本研究所制备的槲皮素纳米乳具有均一稳定的特质.

离心稳定性试验和冷冻试验的结果如图5所示，均表现出稳定状态，结果表明，本研究制备的槲皮素纳米乳宏观稳定性良好.

a、c为对照；b为冷冻后状态；d为离心后状态图5 槲皮素纳米乳稳定性

2.2.3 微观形态

纳米乳的微观形态采用场发射透射电子显微镜进行观察，图6为槲皮素纳米乳在透射电镜下的观察结果.表征结果显示，乳滴之间分散较为均匀，外形规则，呈现完整的球形且界面边缘清晰.但是乳滴粒径的均匀度不十分理想，与粒度分析仪结果有出入，针对此现象进行分析，可能是因为在表征过程中透射电镜发出的加速电子束照射在纳米乳滴表面，造成部分乳滴破乳，从而使其融合聚集使得粒径增大.

图6 槲皮素纳米乳透射电镜图

2.2.4 粒径分布及Zeta电位测定

粒径能够判别纳米乳是否成形，同时也是评价纳米乳稳定的重要性质.经纳米粒度分析仪测定的槲皮素纳米乳粒径分布如图7所示，平均粒径为14.43±0.25 nm，多分散指数(PDI)为0.157，集中分布在6 ～ 29 nm之间.在混合体系中，粒子的分布数量为一条左右较对称的圆滑曲线，显示了正偏态分布特征，说明槲皮素纳米乳的粒径分布范围集中，粒径大小较均匀，符合纳米乳的基本要求.

图7 槲皮素纳米乳粒径分布图

Zeta电位是用来衡量粒子间相互排斥或吸引作用强度的，Zeta电位的绝对值越大，粒子的抗凝聚作用越强，整个系统就越稳定.反之，Zeta电位的绝对值越小，粒子的凝聚作用越强，稳定性就会越弱.如图8所示，室温条件下，测得Zeta电位为1.25 ± 0.45 mV，具有较好的界面滑动能力，乳化体系的稳定性较强.

图8 槲皮素纳米乳Zeta电位分布图

2.2.5 纳米乳对槲皮素增溶程度的表征

(1)色谱条件的确定

色谱柱：C18(10μm，250 × 4.6 mm)；流动相：甲醇-0.4 %磷酸水溶液(50∶50，V/V)；检测波长：360 nm；体积流量：1 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10μL.

(2)标准曲线的建立

精密称取干燥至恒重的槲皮素对照品20 mg，置25 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得800μg/mL对照品母液，避光放置.精密吸取0.01 mL、0.03 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL、3 mL对照品溶液置5 mL容量瓶中，加甲醇定容并摇匀.分别取各浓度对照品溶液10μL，按上述色谱条件进行测定.以槲皮素对照品溶液浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，进行线性回归[21]，得到标准曲线的方程为：y=45.579x-10.043，R2=0.998 4，线性关系良好.

测得槲皮素纳米乳中槲皮素的含量为354.84μg/ mL，相较于槲皮素在水中的溶解度(0.17 ～ 7.7μg/ mL)，将槲皮素制成纳米乳显著提高了溶解度，如表3所示.也表明将难溶性药物制备成纳米乳是提高其水溶性十分有效的方法.

表3 不同分散介质槲皮素的溶解度

(3)槲皮素纳米乳在人工胃液、人工肠液中槲皮素的含量测定

人工胃液：取稀盐酸(取盐酸234 mL，加水稀释至1 000 mL，即得)16.4 mL，加水稀释成1 000 mL即得[22].

人工肠液：取磷酸二氢钾6.8 g，加水500 mL使溶解，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.8得磷酸二氢钾溶液，加水稀释至1 000 mL即得[22].

取上述两种介质各200 mL于烧杯中，各滴加3 mL槲皮素纳米乳，在转速为150 r/min的磁力搅拌器上搅拌2 h.按“2.2.5”节中色谱条件测量槲皮素纳米乳在两种介质中的含量.结果如表4所示，研究制备的槲皮素纳米乳在人工胃液和人工肠液中的溶解度远高于原料药槲皮素在两者中的溶解度，分别为323.27μg/mL和352.64μg/mL，表明本研究制备的纳米乳能很好地释放药物槲皮素.

表4 不同介质槲皮素的含量

3 结论

本研究以乙酸乙酯为油相，选用乳化剂OP-10作为表面活性剂，无水乙醇作为助表活性剂，采用水滴定法制备了槲皮素纳米乳，并通过多种方法对纳米乳进行表征.制备的槲皮素纳米乳外观为浅黄色、澄清透明、流动性良好，属于O/W型纳米乳；平均粒径在14 nm左右，多分散指数(PDI)为0.157，表明粒径分布均匀.稳定性试验显示纳米乳具有良好的稳定性，且制备工艺简单，容易操作.为验证纳米乳对槲皮素增溶效应，采用HPLC测定槲皮素的含量，结果显示，与槲皮素在水中的溶解度(0.17～7.7μg/ mL)相比，槲皮素在纳米乳中的溶解度(354.84μg/mL)显著增加，表明纳米乳作为药物载体能够很好的增加难溶性药物的溶解度，从而增大生物利用度，可为槲皮素纳米制剂提供一定的理论与数据支持.