体外膜氧合再灌注猪心脏死亡供体后肠黏膜屏障功能的改变

马宁，刘蕾，刘懿禾，史源，陈静，张骊，郭庆军，蒋文涛，沈中阳

（1.天津医科大学一中心临床学院，天津300192；2.天津市第一中心医院，天津300192）

近年来，体外膜氧合技术（ECMO）应用于心脏死亡器官捐献（DCD）供体的研究显著增加，特别是对DCD 供体肝、肾等器官的循环支持、体外修复及相关机制研究是目前ECMO 在该领域的研究热点[1-2]。包括肠道在内，DCD 供体器官存在不同程度的低灌注打击和热缺血损伤，肠黏膜屏障损伤可引起肠内菌群异位、毒素入血，从而影响其他组织器官功能[3-4]。ECMO 在对DCD 供体的保护、支持过程中是否会对肠黏膜屏障功能也提供相关保护还是造成进一步损伤尚不完全清楚，因此明确这一过程中肠黏膜屏障功能变化十分必要。本实验应用巴马小型猪，模拟临床建立马斯特里赫特（Maastricht）Ⅱ类DCD 模型，应用ECMO 再灌注DCD 供体后观察肠黏膜屏障功能的变化情况，为ECMO 相关损伤修复机制研究提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 20 只雌雄不限健康成年巴马小型猪作为实验对象，常规饲料喂养，体质量30～35 kg，月龄10～12 个月，实验前给予禁食24 h，禁水12 h处理。

1.2 麻醉与猪心脏死亡模型的建立 经臀大肌注射氯胺酮10 mg/kg、安定0.4 mg/kg 及阿托品0.03 mg/kg 行基础麻醉，麻醉后称体质量，将猪仰卧位固定于恒温手术台，胸前连接五导联心电监护，通过耳缘静脉建立外周静脉通路，给予氯化琥珀胆碱1 mg/kg 诱导麻醉，然后行气管插管，连接麻醉机，设置吸入氧气浓度为40%，流量为1 L/min，潮气量为10 mL/kg，呼吸频率为18 次/min，吸呼比为1:2，术中七氟烷吸入作麻醉维持。麻醉完成后，经颈部右侧纵行切口，游离颈内动脉和颈内静脉并置管，颈内动脉置管用于术中监测平均动脉压及采集血样，颈内静脉置入中心静脉导管，用于术中监测中心静脉压和液体输注。于上腹部正中行纵行切口，充分游离肾动、静脉水平以下腹主动脉和下腔静脉，以备ECMO 置管。参考文献[5]方法建立猪MaastrichtⅡ类心脏死亡模型。静脉推注氯化钾1 g 和肝素3 mg/kg，当心电监护提示出现室颤后使用心肺复苏机给予标准心脏按压[6]，按压频率为100 次/min，按压深度为5 cm，期间呼吸机维持呼吸。心肺复苏（CPR）30 min 后关闭所有心肺支持，心电监护示直线，在5 min 不接触（no touch）时间内若无心电活动及自主呼吸，判定猪心脏死亡。即成功建立猪心脏死亡模型。

1.3 ECMO 建立与运行 判定猪心脏死亡后，迅速经腹主动脉下行分叉水平以上部位置入15Fr ECMO 插管，插管深度为插管尖端应位于肾动脉开口处；再经同一水平于下腔静脉中置入19Fr ECMO 插管，插管尖端位于肝静脉开口处，然后将插管与ECMO 管路连接。其中动脉插管与管路连接中间放置三通管，用于ECMO 运行过程中血压监测及血样采集。剪开膈肌，将胸主动脉贴近膈肌处夹闭，防止血液分流。开始运行ECMO，ECMO 参数设定为：温度 38～39℃，流量 30 mL/kg，氧流量 3 L/min。ECMO运行过程中持续给予肝素泵入抗凝，维持活化凝血时间(ACT)＞300 s。

1.4 样品收集及指标检测 术中及ECMO 运行过程中持续监测生命体征，每分钟记录平均动脉压（MAP）。分别于基础阶段、判定心脏死亡时、ECMO运行2 h、4 h 及6 h 时获取血液标本，酶联免疫分析法测定血清中内毒素、二胺氧化酶（DAO）和肠型脂肪酸结合蛋白（I-FABP）水平；在相同时间点，各获取面积为0.5 cm×0.5 cm 的全层小肠组织用生理盐水冲净肠内容物后，通过甲醛固定、石蜡包埋、切片、HE 染色进行小肠病理检查。

1.5 统计学分析 实验数据采用SPSS19.0 统计软件进行数据处理，计量资料以表示，计量资料比较采用t 检验，P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 实验基本情况 20 头巴马小型猪均成功建立心脏死亡模型，并顺利运行ECMO 6 h。静脉推注氯化钾1 g 后16 头巴马小型猪即刻出现室颤，平均动脉压降至 25 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）以下，至心肺复苏结束，复苏过程中均无自主心率恢复。4 头巴马小型猪在心肺复苏阶段出现自主心率恢复，再次给予氯化钾1 g 后，无自主心率恢复。此方法建立模型效果稳定。ECMO 插管顺利，运行15 min 后，小肠组织基本恢复粉红色。实验过程中，ECMO 流量30～35 mL/（kg·min），氧流量3 L/min，平均动脉压基础值为（82.25±5.07）mmHg，ECMO 运行过程中为（78.38±6.11）mmHg。持续肝素泵入，维持活化凝血时间（ACT）＞300 s。

2.2 血清学指标变化 与基础阶段比较，判定猪心脏死亡后，血清内毒素、DAO 及I-FABP 均明显升高（均 P＜0.05）。ECMO 运行开始后，血清内毒素和DAO 在 2 h 及 4 h 时均呈明显下降趋势（均 P＜0.05），ECMO 运行6 h 时内毒素水平有轻度上升，DAO 较4 h 无明显变化；血清I-FABP 呈先缓慢下降，后升高趋势，在ECMO 运行前2 h 有所下降，但差异无统计学意义（P＞0.05），ECMO 运行 4 h 时，下降显著，到 6 h 时 I-FABP 水平明显升高（P＜0.05，表 1）。

2.3 小肠组织病理学变化 当判定猪心脏死亡后，小肠组织外观呈现淤紫暗红色，肠壁无弹性、无水肿，小肠表层被覆上皮不完整、较多脱落，绒毛及黏膜腺体排列不规则，固有层中可见大量淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及浆细胞。随着ECMO 的运行，小肠组织逐渐恢复粉红色，颜色均匀，肠壁弹性逐渐恢复，肠蠕动明显；病理表现亦有好转趋势，当ECMO运行至2 h 及4 h 时，光镜下均见小肠表层被覆上皮偶见脱落，至ECMO 运行4 h 时，部分绒毛排列不规则，肠黏膜腺体排列大致规则，固有层有少量淋巴细胞、嗜酸性粒细胞及浆细胞浸润；当ECMO运行时间超过4 h 后，肉眼可见肠壁开始水肿，并呈逐渐加重趋势，弹性较前变差，蠕动逐渐减弱，6 h病理切片可见小肠表层被覆上皮偶见脱落，部分绒毛脱落及萎陷，肠黏膜腺体排列大致规则，炎细胞浸润较前加重（图1）。

表1 实验过程中血清内毒素、DAO 及I-FABP 水平的变化（）Tab 1 Changes of endotoxin, DAO and I-FABP levels during the experiment（）

表1 实验过程中血清内毒素、DAO 及I-FABP 水平的变化（）Tab 1 Changes of endotoxin, DAO and I-FABP levels during the experiment（）

注：基础阶段为未推注氯化钾诱导心脏死亡前；DAO 为二胺氧化酶，I-FABP 为肠型脂肪酸结合蛋白；与前一时间点血清学指标水平比较，aP＜0.05，bP＞0.05；与心脏死亡时比较，cP＜0.05，dP＞0.05

检测时间点 n 内毒素（EU/mL）DAO（U/mL）I-FABP（ng/mL）基础阶段 20 0.231±0.032 51.83±8.70 17.91±3.12心脏死亡时 20 0.386±0.031a 76.63±9.36a 23.88±3.21a运行 ECMO 2 h 20 0.305±0.034a 66.28±5.98a 22.03±1.38b运行 ECMO 4 h 20 0.243±0.021ac 60.22±5.41ac 17.86±1.73ac运行 ECMO 6 h 20 0.251±0.023bc 59.36±8.40bc 22.48±1.96ad

图1 建立猪心脏死亡模型及运行ECMO 过程中小肠组织病理改变（HE 染色×200）Fig 1 Pathological changes of the small intestinal in the process of establishing pig cardiac death model and ECMO circuit(HE×200)

3 讨论

ECMO 已有近70 年的应用历史，随着器材的不断改进以及近年来器官移植技术和研究的快速发展，ECMO 广泛应用于供体移植物的保护、移植受者生命支持及移植后各种并发症的抢救等[7]，特别是为缓解临床供体短缺，ECMO 对DCD 器官供体的循环支持及质量修复成为研究热点之一[8-9]。目前，国际上认为最具扩大供体器官来源的是Maastricht 心脏死亡分类标准中的Maastricht Ⅱ类[10]。因此本实验设计建立在此类心脏死亡供体模型基础上。相关研究表明，ECMO 技术可以用来选择改善Maastricht Ⅱ类供体器官质量，西班牙巴塞罗那大学Fondevila 等[11]应用ECMO 在体修复4 h，使供体器官得到一定程度的恢复，后因供体腹腔渗出增多、ECMO 流量难以维持，腹腔器官质量变差而停止。截至目前，ECMO 对DCD 供体器官的保护机制尚不十分明确。包括肠道在内，DCD 供体器官存在不同程度的低灌注打击和热缺血损伤，肠黏膜结构和功能的损伤，可引起肠道细菌移位、内毒素入血，诱发全身炎性反应，从而造成多种组织器官的损害。相关研究认为，体外循环病人的肠道是导致脓毒血症、全身炎性反应综合征（SIRS）和多系统器官功能衰竭（MODS）的重要器官，是损伤的始动器官[12-13]。基于以上考虑，本实验深入探讨ECMO 再灌注DCD 供体过程中肠黏膜屏障功能是否能够得到有效保护，还是进一步加重黏膜损伤，为这一过程中肝、肾、胰腺等其他器官的功能变化及相关机制研究提供新的思路。

笔者用静脉推注氯化钾，继而给予标准心肺复苏的方法成功建立了巴马小型猪Maastricht Ⅱ类心脏死亡捐献模型，模型成功率高、易于标准化。ECMO运行过程稳定，转速和流量分别为2 000～2 500 r/min和30～35 mL/（kg·min），运行ECMO 6 h 维持有效平均动脉压（78.38±6.11）mmHg，保证了肠道血液灌注。在ECMO 运行15 min 后，肠道即恢复均匀粉红色，接近正常颜色，利用肝素在建立心脏死亡模型及ECMO 运行过程中抗凝有效，血液灌注理想。评价肠黏膜屏障功能指标除病理学观察，血清中DAO能准确、快速地反应肠道机械屏障的完整性和损伤程度，小肠黏膜中DAO 活性与黏膜上皮细胞的核酸和蛋白质合成相关，当肠黏膜屏障受损，DAO 进入肠细胞间隙淋巴管和血管中，血DAO 升高[14-15]。I-FABP 在黏膜中的含量最丰富，由于黏膜层对缺血最为敏感，肠缺血时I-FABP 能较早释放，当肠道缺血15 min 后血清中即迅速增加，由于I-FABP 的特异性和敏感性，使其在判断黏膜损伤程度方面具有显著优势[16]。内毒素是革兰阴性细菌细胞壁中的一种成分，检测其血液浓度可以反映肠黏膜通透性和细菌入血情况[17-18]。判定心脏死亡后，肠道呈现淤紫状态、弹性较差，黏膜上皮部分脱落，绒毛萎缩，固有层大量炎性细胞浸润，血清学指标均大幅升高，整体表现显示肠道经历严重的缺血缺氧后导致炎性反应和肠上皮细胞及结构损伤。ECMO 运行2 h和4 h 的检测结果显示肠黏膜组织病理相比心脏死亡后均有不同程度好转，黏膜上皮坏死脱落减轻，绒毛排列大致规则，炎性细胞浸润明显减少，内毒素、DAO 和I-FABP 随时间延长有逐渐下降趋势。ECMO 运行能够为肠道提供充足的氧气和营养，维持肠道的生理温度，有利于肠黏膜上皮细胞的恢复，保护黏膜屏障功能。ECMO 运行6 h 后，肠壁水肿、变薄，肠蠕动减弱，腹腔渗出增多，黏膜固有层炎细胞大量浸润，血清内毒素和DAO 变化不明显，I-FABP 从前4 h 的逐渐下降趋势转为快速上升，综合以上结果提示肠黏膜屏障功能没有得到持续保护，反而有恶化趋势。在本实验的预实验中，ECMO运转超过6 h 后，因腹腔渗出增多，通过补液升压等措施后，流量仍难以维持，腹腔脏器颜色和质地明显变差，ECMO 体外灌注的目的是保护和支持脏器功能，因此实验没必要继续延长ECMO 运行时间来观察肠黏膜屏障功能变化。

ECMO 作为一种中短期心肺替代辅助治疗技术，可以为DCD 供体提供有效的血液灌注和氧供，短期运行对肠道具有保护支持作用，维护黏膜屏障功能，减少菌群异位及毒素入血，为其他腹腔脏器修复提供良好的循环微环境。但同时，ECMO 作为一种侵入性技术，能激活炎症反应，本实验证实长时间运行ECMO 会引起肠黏膜屏障功能的进一步损伤，炎症反应严重，可能成为移植术后相关并发症的潜在使动因素，因此有待进一步研究。本实验为今后ECMO 对DCD 供体器官的损伤修复机制和肠道功能损伤相关性研究提供新的思路和依据。