红麻副产品栽培中华红芝发酵液美白抗氧化研究

王亚惠，谢纯良，周映君，龚文兵，朱作华，彭源德

（中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙410205）

灵芝（Ganoderma lucidum）又称“瑞芝”、“仙草”，属担子菌亚门（Basidiomycotina），非褶菌目（Aphyllophorales），多孔菌科（Polyporaceae），灵芝属（Ganoderma），是一种珍稀食药用真菌，在中国已有2000多年的药用历史[1]。灵芝的药理活性成分很多，包括多糖、三萜和生物碱等十余种活性成分[2，3]，应用范围广泛，不但具有医疗效果[4]，而且具有美容和保健功能[5-7]。传统的灵芝栽培多以木屑、棉籽壳为原料，但近年来由于资源日趋贫乏、运输成本高、农药残留高等问题，亟需寻找生产成本低廉的栽培原料替代品。麻类副产品具有质地疏松、吸水性极强、不板结、透气性较好等物理特性，因此成为灵芝栽培的一种理想原料。同时，本实验室前期研究结果表明，麻类副产品栽培灵芝较常规栽培灵芝，蛋白质、三萜、多糖等物质的含量更丰富。

灵芝作为一种传统名贵中药，长期以来便被认定具有特殊的美白、延缓衰老等功效[8]。因此，在现代化妆品中，以灵芝为功能性原料开发的化妆品种类甚多。据统计，目前市面上主打灵芝概念的化妆品系列多达十余种，但其中的灵芝成分主要为灵芝子实体提取物。灵芝中活性成分提取方法各异，水提取和醇提取法以低成本、安全、无污染的优势应用最为广泛。但其同样存在杂质含量高、操作麻烦、对提取物活性损耗较大等缺点[9]。随着人们对化妆品天然性需求的增高，操作条件温和、无污染、能耗小的生物提取技术越来越多被用于高端化妆品中。例如，利用益生菌发酵可以有效提取人参、五倍子等多种中草药的活性成分，用于护肤品的开发。同时，研究表明Kefir粒发酵的灵芝提取液具有良好的保湿作用，且效果显著优于酿酒酵母菌和纳豆芽胞杆菌[10]。但目前为止，生物发酵对灵芝提取液的抗氧化和美白功效的研究还鲜有报道。本研究比较了酿酒酵母、保加利亚乳杆菌及其复合菌种发酵对红麻副产品栽培中华红芝多糖、三萜的提取效率影响，及其发酵液的抗氧化和美白功效差异，从而揭示了灵芝功效性成分多糖、三萜对其发酵液美白功效的重要作用，为灵芝生物发酵技术在化妆品领域的应用奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

供试菌株中华红芝A-1916，由江苏高邮市科学食用菌研究所提供。红麻副产品由中国农业科学院麻类研究所红麻育种研究室提供，晒干打碎后，以58%的添加量配制灵芝栽培基质并进行中华红芝栽培，所得中华红芝子实体用于本研究实验分析。供试发酵菌种酿酒酵母（简称Sc）和保加利亚乳杆菌（简称Lb）均来源于实验室保存菌种。

1.1.2 主要试剂

L-酪氨酸，购自北京索莱宝生物科技有限公司；酵母提取物，购自汉尼生物技术有限公司；葡萄糖、香草醛，购自天津科密欧化学试剂有限公司；盐酸、碳酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、无水乙醇、冰醋酸、高氯酸、氯仿，购自湖南汇虹试剂有限公司；酪氨酸酶，购自博美生物科技有限公司；1，1-二苯基-2苦肼基自由基（DPPH）、齐墩果酸，购自上海梯希爱化成工业发展有限公司；大豆蛋白胨，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；蒸馏水，实验室自制；SIGMA 3K15台式高速冷冻离心机，购自北京思博晟达科技有限公司。

1.1.3 培养基

PDA培养基（g／L）：马铃薯 200 g（去皮），葡萄糖 20 g，琼脂 20 g，蒸馏水 1000 mL，121℃灭菌20 min。MRS肉汤培养基（g／L）：MRS肉汤49.25 g，蒸馏水1000mL，115℃灭菌30min。YPD培养基（g／L）：酵母提取物10 g，葡萄糖20 g，大豆蛋白胨20 g，酵母膏 1 g，蒸馏水1000 mL，115℃灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种培养

酿酒酵母的培养：于4℃冰箱中取出保藏的菌种，于无菌条件下取一环菌种接种至10 mL YPD培养基中，25℃避光培养2 d，活化。再以2%的接种量接种至200 L新鲜YPD培养基中，25℃避光培养24 h，测定其菌浓度并调节至108CFU／mL备用。

保加利亚乳杆菌的培养：于4℃冰箱中取出保藏的菌种，于无菌条件下取一环菌种接种至10 L MRS培养基中，35℃避光培养24 h，活化。再以2%的接种量接种至200 L新鲜MRS肉汤培养基中，35℃避光培养24 h，测定其OD 600并稀释至1.0备用。

1.2.2 中华红芝子实体发酵液的制备

取中华红芝子实体，与无菌水按1：20（g：mL）混合均匀后打浆，即得灵芝浆液。向灵芝浆液中添加5%（W／V）葡萄糖，随后进行如下处理：a）接种6.5%酿酒酵母于灵芝浆液中，并于25℃下避光静置发酵72 h；b）接种6.5%保加利亚乳杆菌于灵芝浆液中，并于35℃下避光静置发酵48 h；c）接种6.5%酿酒酵母于灵芝浆液中，并于25℃下避光静置发酵72 h；随后向灵芝发酵液中添加3%（W／V）葡萄糖，并接种6.5%保加利亚乳杆菌于灵芝浆液中，于35℃下避光静置发酵48 h。将发酵产物在5000 g条件下离心25 min，弃沉淀，收集上清液，通过0.22μm滤膜过滤，即为中华红芝子实体发酵液。

1.2.3 多糖含量测定

测定方法参照何云庆[11]。葡萄糖标准曲线的绘制及测定方法：分别用超纯水配制浓度为0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08 mg／mL的葡萄糖标准溶液 1 mL，向试管中加入等体积5%苯酚溶液，随后快速加入浓硫酸5 mL，振荡后静置反应30 min，490 nm测吸光度。以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线图。

分别取三种处理发酵液1mL于50mL离心管中，加入3倍体积的95%乙醇醇析24 h，5000 g，离心20 min，弃上清，将沉淀于超低温冷冻干燥机中干燥2～3 h，再加20 mL超纯水将沉淀物溶解稀释到合适的浓度，充分溶解后，吸取1 mL该待测液，按照上述苯酚-硫酸法测得吸光值，再通过葡萄糖标曲计算待测液得多糖含量，并以初始灵芝浆液为对照进行比较分析。

1.2.4 三萜含量测定

测定方法参照石凤敏[12]。精确移取浓度为 100μg／mL的齐墩果酸溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL置于试管中，进行水浴加热直至溶剂挥干，再加入0.4 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液以及1 mL的高氯酸，迅速混合均匀后进行65℃15 min的水浴加热；用自来水充分冷却后用冰醋酸定容至5 mL，于550 nm处测吸光度值；以齐墩果酸的质量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。取样液0.1 mL于试管中，加入0.9 mL无水乙醇室温下放置1 h左右，沸水浴加热使液体挥发，加入0.4 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液以及1 mL的高氯酸，迅速混合均匀后进行65℃15 min的水浴加热；用自来水充分冷却后用冰醋酸定容至5 mL，于550 nm处测吸光度值，再通过标准曲线计算三萜含量，并以初始灵芝浆液为对照进行比较分析。

1.2.5 清除DPPH自由基能力测定

取1 mL待测液加1mL浓度为0.2mmol／L的DPPH，室温下静置30min后，在517 nm波长处测吸光度值，根据吸光度代入如下公式中，计算DPPH清除率。

DPPH清除率（%）=[1-（Ai-Aj）／A0]×100%；

式中：Ai为1mL的DPPH+1 mL样品的吸光度；Aj为1 mL溶剂+1 mL样品的吸光度；A0为1 mL DPPH+1 mL溶剂的吸光度。

1.2.6 超氧阴离子自由基清除能力测定

取5.7 mL的50 mmol／L pH 8.2的Tris-HCl缓冲液于10 mL EP管中，向其中加入0.2 mL样液，混匀后于25℃保温10min，然后加入于25℃条件下预热的10mmol／L的邻苯三酚溶液0.1mL，总体积为6 mL，迅速摇匀后用紫外-可见分光光度计记录其在320 nm波长处1 min内吸光度的增加值（As）。计算线性范围内每分钟吸光度的增加值。另取试剂同上，将样液用等体积水替代，同样测定其在320 nm波长下，1 min内吸光度的增加值（A0）。根据下述公式计算超氧阴离子自由基清除率：超氧阴离子自由基清除率 （%）=（A0-As）／A0×100%。

1.2.7 酪氨酸酶抑制率测定方法

参照张智萍等[12-14]的方法。用微量移液器分别按下表1的体积准确吸取 T1、T2、T3、T4中的酪氨酸酶、PBS及样品的反应液分别置于4个PE管中，混匀，37℃恒温水浴10 min，然后在T2、T4中分别加入1 mL的L-酪氨酸，37℃反应10 min，快速置于冰水中冷却。用酶标仪在475 nm处测定其吸光度AT1、AT2、AT3、AT4。按以下公式计算样品抑制酪氨酸酶的活性：

其中，AT1：未加样品且未加酪氨酸酶的反应液在475 nm处测得的吸光度

AT2：未加样品加酪氨酸酶的反应液在475 nm处测得的吸光度

AT3：加样品而未加酪氨酸酶的反应液在475 nm处测得的吸光度

AT4：加样品和加酪氨酸酶的反应液在475 nm处测得的吸光度

表1 反应体系Table1 Reaction system

1.3 数据处理

运用Excel 2013进行数据整理、方差分析、相关性分析；采用SPSS对不同处理条件下多糖、三萜、DPPH清除率、超氧阴离子清除率、酪氨酸酶抑制率差异显著性进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 酿酒酵母和保加利亚乳杆菌发酵对中华红芝子实体总糖和三萜溶出量的影响

中华红芝子实体中含有多种生物活性成分，但需要适宜的方式进行提取才能进行有效利用。本研究分别利用酿酒酵母和保加利亚乳酸菌对中华红芝子实体进行了单一发酵和复合发酵处理，分别检测了各处理发酵液中两种主要活性物质的含量。结果表明，与对照相比，经酿酒酵母和保加利亚乳杆菌发酵处理后的灵芝发酵液中总糖和三萜均有所增加。由图1可知，酿酒酵母与保加利亚乳杆菌复合发酵处理效果最佳，其灵芝浆液总糖与三萜含量显著高于未发酵灵芝浆液与两种菌单独发酵处理的灵芝浆液（P＜0.01），分别可达369.6μg／mL与249.3μg／mL。此外，在未发酵灵芝浆液中灵芝三萜的溶出量极低，但经三种生物发酵处理后，其溶出含量分别达167.4μg／mL、133.1μg／mL、249.3μg／mL。由此可见，酿酒酵母和保加利亚乳杆菌发酵可以显著提高中华红芝子实体的总糖和三萜溶出量。

图1 酿酒酵母和保加利亚乳杆菌发酵对中华红芝子实体总糖和三萜溶出量的影响Fig.1 Effects of fermentation with Saccharomyces cerevisiae and／or Lactobacillus bulgaricus of saccharides and triterpenoids contents of G.lucidum.

2.2 中华红芝子实体发酵液抗氧化性和美白功效分析

为探究中华红芝子实体发酵液的抗氧化性和美白功效，分别对其清除DPPH自由基能力、超氧阴离子清除能力、酪氨酸酶抑制能力进行了评估。结果如图2所示，发酵后灵芝浆液的DPPH自由基清除率、超氧阴离子清除率较未发酵灵芝浆液有显著提升。其中酿酒酵母发酵72 h的灵芝发酵液的DPPH清除率高达40.5%，显著高于其他两个发酵处理。而不同发酵方式灵芝发酵液的超氧阴离子清除能力却较为一致，差异不显著。此外，以酪氨酸酶抑制率为指标测定不同处理条件下灵芝浆液的美白功效，结果表明不同发酵方式处理的灵芝发酵液美白功效均有显著提高（P＜0.01），其中酿酒酵母与保加利亚乳杆菌复合发酵处理灵芝发酵液美白功效最佳，其灵芝浆液酪氨酸酶抑制率显著高于未发酵灵芝浆液与两种菌单独发酵处理的灵芝浆液（P＜0.01），可达42.4%。由此可见，发酵处理可以有效提高中华红芝浆液的抗氧化能力和美白功效。

图2 不同发酵方式对中华红芝浆液抗氧化和酪氨酸酶抑制功效的影响Fig.2 Effects of different fermentation methods on antioxidant activity and tyrosinase inhibition of G.lucidum.

2.3 中华红芝子实体发酵液与水／醇提取液抗氧化性和美白功效的比较分析

为评估中华红芝子实体发酵液在化妆品中的应用潜力，本研究利用中华红芝子实体水／醇提取液与发酵液进行了比较分析，结果如图3所示。与中华红芝水／醇提取液相比，酿酒酵母与保加利亚乳杆菌复合发酵所得发酵液的DPPH自由基清除率与水提取液差异不明显，但显著低于醇提取液。但其超氧阴离子清除率和酪氨酸酶抑制率则显著高于中华红芝水／醇提取液，分别高达20.96%和42.4%（P＜0.01）。由此可见，中华红芝复合发酵液具有良好的抗氧化和美白功效，在化妆品领域有良好的应用潜力。

图3 中华红芝子实体发酵液与其水／醇提取液抗氧化和酪氨酸酶抑制功效比较Fig.3 Comparison of antioxidant and tyrosinase inhibitory effects between fermentation broth and water／alcohol extract of G.lucidum

2.4 中华红芝子实体多糖和三萜的美白功效分析

为探究中华红芝子实体发酵液多糖和三萜含量的增加与其酪氨酸酶抑制率提高的相关性，本研究将发酵液多糖和三萜进行了提取，并对其酪氨酸酶抑制率进行测定，结果表明，1 mg中华红芝子实体发酵液多糖的酪氨酸酶抑制率为27.32%，而0.5 mg中华红芝子实体发酵液三萜的酪氨酸酶抑制率则为69.68%（图4）。由此可见，多糖和三萜均具有酪氨酸酶抑制作用，但三萜的抑制作用更为显著。

图4 中华红芝子实体发酵液多糖和三萜酪氨酸酶抑制活性比较Fig.4 Comparison of inhibitory activity of polysaccharides and triterpene tyrosinase in fermentation broth of G.lucidum.

3 讨论

灵芝在我国拥有悠久的使用历史，传统医学将其视为滋补强壮、固本扶正的名贵中药。《本草纲目》有记载“灵芝补中益气，增智慧，好颜色，久食轻身不老，延年神仙”。由此可见其美容功效卓著。在系统的传统中医药理论背景基础上，加之目前市场上自然、绿色概念化妆品的盛行，使得灵芝成分在化妆品领域的运用愈发广泛[14]。灵芝功能性活性成分复杂，其中以子实体的活性成分最为丰富。灵芝子实体是一种致密的伞状结构，为获得其中的有效成分，通常会采用不同的处理方式，一般以乙醇提法、水提法使用最广泛。但其提取物杂质含量高、处理过程中物质活性损失是水／醇提法不可避免的缺陷。同时，在追求化妆品绿色、天然的大趋势下，物理提纯方式则不再是最优选择。

近年来，利用微生物发酵技术进行生物活性物质的转化与提取成为了化妆品界的研究热点，也取得了诸多新进展[15]。例如，苏宁（2017）等利用一株黄酒酵母对红景天根进行发酵，得到的红景天发酵原浆具有较好的美白和抗氧化功效，其10%发酵原浆的DPPH清除率和酪氨酸酶抑制率均可达到80%。同时，发酵液含有小分子量活性肽，易被皮肤吸收，对人体有较好的安全性[16]。李瑜（2018）发现酵母和乳酸菌混合发酵包含红景天、五倍子、绿茶叶、丁香的复合中药后其酪氨酸酶抑制率提高37.34%，总还原力达到27.85 mmol／L，总酚含量提高至147.8 mg／g。此外，葡萄籽乳酸菌发酵液、芦荟乳酸菌发酵液、核桃青皮果蔬发酵液、龙舌兰乳酸菌酵母复合发酵液、人参无患子乳酸菌发酵提取液等均被证实具有抗衰老等多种美容功效，可有效应用于化妆品中[17-22]。总体而言，微生物转化对生物活性物质的提取作用更温和，能够最大程度的保留被提取物中的天然活性成分，降低毒副作用，同时微生物在代谢过程中产生的多种活性酶达到增效的作用，具有极大的应用前景。目前为止，尚未有人对灵芝进行微生物发酵处理评价其化妆品功效。因此，本研究中利用酿酒酵母和保加利亚乳杆菌对红麻副产品栽培中华红芝进行了发酵试验，同时研究结果也证实中华红芝发酵液具有良好的抗氧化和酪氨酸酶抑制活性，其DPPH清除率、超氧阴离子清除率和酪氨酸酶抑制率较发酵前分别提高32.5%、2.66倍和1.15倍，并显著高于中华红芝的水提和醇提液。由此可见，酵母和乳酸菌发酵可用作灵芝功效成分提取的有效方式，可有效应用于灵芝类化妆品的研发。

此外，研究中发现中华红芝子实体发酵液酪氨酸酶抑制能力增强与其发酵液中多糖和三萜含量增加有关。将发酵液中的多糖和三萜进行提纯后，分别测定其酪氨酸酶抑制率，结果证实灵芝三萜和多糖均具有酪氨酸酶抑制活性作用，但灵芝三萜的抑制能力更强，该结果与前人研究结果类似。陆易[23]通过对乙酸乙酯提取后的灵芝三萜进行分析发现灵芝萜烯酮醇和过氧化麦角甾醇能通过影响黑色素B16细胞的合成，进而有效地抑制黑色素的分泌和释放。此外，Ji-Woog[24]的研究结果也表明灵芝萜酮二醇亦可抑制黑色素的合成。从灵芝菌丝体、孢子粉、子实体和发酵液中分离得到的三萜类化合物有上百种[25]，且不同灵芝品种的三萜种类及含量存在较大差异。目前为止，中华红芝中的美白功能性成分尚无具体文献报道。而本研究证实三萜类物质为中华红芝子实体的主要美白成分，其具体的美白因子种类尚有待进一步研究。