几种鱼蛋白肽体外结合胆酸盐的效果研究

关计兰，张乐云，肖 莺，杨 萍

（广东海洋大学食品科技学院，广东湛江 524088）

据统计，近年来高血脂的发生率明显呈上升趋势[1]，且主要集中在中老年人群中出现[2]，高血脂能够引发很多严重影响人体健康的病症，如动脉粥样硬化、冠心病、胰腺炎等，并且高血脂的并发症有高血压和糖尿病，对人体健康危害极大[3]，在高血脂的预防和治疗方面都应引起重视，目前市面上流通的治疗高血脂的化学类药物因见效快而受到患者的青睐，但是这些药物都会引起不同程度的副作用。近年来，具有辅助降血脂的功能性食品开发成为国内外最热门的领域之一。目前，很多研究发现结合胆酸盐的物质，可以将胆汁酸排出体外，促使胆固醇不断转化为胆汁酸，以维持胆汁酸池的动态平衡，从而降低血液中胆固醇的含量[4]，从而起到降血脂的作用。鱼蛋白肽作为一种生物活性物质，可以由鱼及其加工副产品酶解而得到，原材料种类众多、资源充足。有关鱼蛋白肽结合胆酸盐效果的研究不多，江锟等人[5]发现，鲈鱼蛋白酶解液在体外结合胆酸盐的效果与酶解时间有关，酶解 5 h 时的酶解液的效果与处方降血脂药物考来烯胺相当；朱晓连等人[6]发现，卵形鲳鲹鱼肉胰蛋白酶解物对甘氨胆酸钠体外结合率达到同浓度考来烯胺的48.3%。试验比较了罗非鱼肉肽、罗非鱼皮肽、鲣鱼肽的体外结合胆酸盐的效果，以期为其进一步的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

罗非鱼肉肽A（罗非鱼肉按照优化的酶解工艺条件酶解、离心、微滤后浓缩喷雾干燥而得到）、罗非鱼皮肽B（罗非鱼皮按照优化的酶解工艺条件酶解、离心、微滤后再经截留限为1 kU 超滤所得的截留液浓缩、喷雾干燥而得到）、罗非鱼皮肽C（罗非鱼皮按照优化的酶解工艺条件经酶解、离心、微滤后再经截留限为1 kU 的超滤所得的透过液浓缩、喷雾干燥而得到）、鲣鱼肽D（去内脏的鲣鱼按照优化的酶解工艺条件酶解、离心、微滤后再经截留限为300 U 的纳滤得到的截留液浓缩、喷雾干燥而得到））、鲣鱼肽E（去内脏的鲣鱼按照优化的酶解工艺条件经酶解、离心、微滤后再经截留限为300 U 的纳滤得到的透过液浓缩、喷雾干燥而得到），分别由实验室制备；胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠，美国Sigma 公司提供；考来烯胺，南京厚生药物有限公司提供；福林酚试剂盒，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司提供；其他试剂均为分析纯。

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1.2 方法

1.2.1 可溶性蛋白质含量测定

采用福林酚法，标准曲线方程为Y=0.008X+0.005，R2=0.998。

1.2.2 胆酸盐含量标准曲线的建立

参考张婷婷等人[7]的试验并稍作修改。精密称取干燥至恒质量的胆酸盐标准品50 mg，置于50mL 容量瓶中，加入蒸馏水溶解，并加至刻度，摇匀。精密吸取25 mL，置于另一个50 mL 容量瓶中，加蒸馏水至刻度处，摇匀备用。吸取0.5 mg/mL 的胆酸盐标准溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，分别置于具塞试管中，加入蒸馏水至2.5 mL，再加入约51.5%的硫酸7.5 mL，置于70 ℃水浴中加入20 min，然后取出冰浴5 min，于波长387.5 nm 处测吸光度（A），以吸光度A 为纵坐标，质量浓度（C）为横坐标，得到吸光度与胆酸盐标准溶液浓度的线性方程，绘制标准曲线。得到3 种胆酸盐的标准曲线：胆酸钠的线性回归方程为Y=15.00X+0.114，R2=0.999；甘氨胆酸钠的线性回归方程为Y=17.96X+0.081，R2=0.998；牛磺胆酸钠的线性回归方程为Y=13.83X+0.064，R2=0.999。

1.2.3 鱼蛋白肽结合胆酸盐能力的测定

准确称取500 mg 的5 种不同鱼蛋白肽和阳性对照考来烯胺置入锥形瓶，分别加入30 mL 质量浓度为0.2 mg/mL 的不同的胆酸盐溶液，在37 ℃条件下水浴1 h，以蒸馏水为样品空白，以胆酸盐溶液为试剂空白。以转速16 000 r/min 离心20 min，取上层清液，测定吸光度A，由标准曲线求得上清液中胆酸盐的质量浓度，分别计算鱼蛋白肽对胆酸盐的结合率和结合量。

式中：A1——样品空白的吸光度；

A2——样品结合胆酸盐后的吸光度；

A3——试剂空白的吸光度；

V——胆酸盐溶液/蒸馏水体积，mL；

M——样品质量，mg。

1.2.4 模拟胃肠道环境对鱼蛋白肽结合胆酸盐能力的影响

参考朱晓连等人[6]的试验并稍作修改。取质量浓度600 mg/mL 的罗非鱼肉肽溶液2 mL 于25 mL 具塞试管中。加入2 mL HCl（浓度为0.01 mol/L），在37 ℃水浴中恒温振荡1 h（模拟胃环境）。随后加入NaOH溶液（浓度为0.1 mol/L）调节pH 值至6.3。再加入10 mL 猪胰酶溶液（质量浓度为10 mg/mL 的模拟肠环境）和8 mL 配置好的胆酸盐溶液（质量浓度为0.3 mg/mL），在37 ℃水浴下恒温振荡1 h。以磷酸盐缓冲液作为样品空白，以胆酸盐溶液为试剂空白。将恒温振荡后的样品转入离心管，以转速16 000 r/min 离心20 min。取上清液2.5 mL 于25 mL具塞试管中，加入硫酸7.5 mL，于70 ℃条件下水浴20 min。冰浴5 min 冷却后，于波长387.5 nm 处测定吸光度，由标准曲线求得上清液中胆酸盐的浓度，分别计算结合率和结合量。

2 结果和分析

2.1 5种鱼蛋白肽的可溶性蛋白质含量

5 种鱼蛋白肽的可溶性蛋白含量见表1。

表1 5 种鱼蛋白肽的可溶性蛋白含量 / mg·g-1

由表1 可见，罗非鱼皮肽C（<1 kU）的可溶性蛋白含量最高，罗非鱼肉肽A、罗非鱼皮肽B（>1 kU），鲣鱼肽D（>300 U）、鲣鱼肽E（<300 U）可溶性蛋白含量相仿且较低。可溶性蛋白质含量的高低与肽的水解度有关。

2.2 5种鱼蛋白肽对3 种胆酸盐的结合效果

5 种鱼蛋白肽对胆酸盐结合率和结合量的影响见表2。

由表2 可知，罗非鱼肉肽A 对3 种胆酸盐都有一定的结合能力，对牛磺胆酸钠的结合率和结合量最高为38.27%和1.32 mg/g，其次是对甘氨胆酸钠的为34.07%和1.04 mg/g，对胆酸钠的最低为20.80%和0.82 mg/g；而罗非鱼皮肽B（>1 kU）对3 种胆酸盐都没有结合效果；罗非鱼皮肽C（<1 kU）对牛磺胆酸钠有微弱的结合效果，结合率和结合量只有0.82%和0.03 mg/g；鲣鱼肽D（>300 U）对3 种胆酸盐都没有结合效果；鲣鱼肽E（<300 U）对牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠都有结合效果，结合率和结合量分别为21.52%和0.74 mg/g，7.25%和0.22 mg/g。总体来说，没有经过分级分离的罗非鱼肉肽、分子量较小的组分鲣鱼肽E<300 U和罗非鱼皮肽C<1 kU 具有一定的结合胆酸盐能力，其中以罗非鱼肉肽的效果最好。而考来烯胺对3 种胆酸盐都有较高的结合率和结合量，对胆酸钠的可达93.10%和3.67 mg/g，对牛磺胆酸钠达97.18%和3.36 mg/g，对甘氨胆酸钠达94.73%和2.88 mg/g。比较可知，罗非鱼肉肽结合牛磺胆酸钠的能力约为考来烯胺的40%。据报道牛磺胆酸钠是属于较难被结合的结合型胆酸盐，容易结合牛磺胆酸钠的物质，对其他胆酸盐也有结合能力。因此，选择罗非鱼肉肽进一步研究。

表2 5 种鱼蛋白肽对胆酸盐结合率和结合量的影响

2.3 罗非鱼肉肽用量对胆酸盐结合的影响

罗非鱼肉肽用量对胆酸盐结合率和结合量的影响见表3。

表3 罗非鱼肉肽用量对胆酸盐结合率和结合量的影响

由表3 可知，从结合率看，罗非鱼肉肽对牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠的结合能力均随用量增加而增加的。从结合量看，罗非鱼肉肽的添加量在超过500 mg 之后，对3 种胆酸盐的结合能力都下降，所以无论是从结合率还是结合量来看，罗非鱼肉肽用量在450～500 mg，即15.0～16.7 mg/mL 时，较为适宜。

2.4 模拟胃肠道环境对罗非鱼肉肽结合胆酸盐的影响

模拟胃肠道环境对罗非鱼肉肽结合胆酸盐结合率和结合量的影响见表4。

表4 模拟胃肠道环境对罗非鱼肉肽结合胆酸盐结合率和结合量的影响

由表4 可知，在模拟经过人体的胃部消化、再到pH 值为6.3 小肠后，罗非鱼肉肽对3 种胆酸盐都有结合能力，但是与没有模拟胃肠道环境的结果相比，罗非鱼肉肽对胆酸钠的结合能力明显下降，结合率和结合量仅为2.46%和0.10 mg/g，而对牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠的结合率和结合量分别为43.69%和1.75 mg/g，37.31%和1.49 mg/g，对比表3 可知，此时罗非鱼肉肽对牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠的结合能力都提高了。

2.5 时间对罗非鱼肉肽结合胆酸钠的影响

时间对罗非鱼肉肽结合胆酸钠结合率和结合量的影响见表5。

表5 时间对罗非鱼肉肽结合胆酸钠结合率和结合量的影响

由表5 可知，罗非鱼肉肽对胆酸钠的结合率和结合量随着时间的延长而增大，60 min 基本达到平衡，80 min 最大为31.15%和1.06 mg/g，而考来烯胺能够迅速结合胆酸钠，20 min 时结合率和结合量可达98.12%和3.45 mg/g，且基本达到平衡。

3 结论

通过研究罗非鱼肉肽、罗非鱼皮肽B（>1 kU）、罗非鱼皮肽C（<1 kU）、鲣鱼肽D（>300 U）、鲣鱼肽E（<300 U）5 种鱼蛋白肽对胆酸钠、牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠的结合能力，发现罗非鱼皮肽B、鲣鱼肽D 对3 种胆酸盐都没有结合能力，罗非鱼皮肽C对牛磺胆酸钠、鲣鱼肽E 对牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠有较弱的结合能力，而罗非鱼肉肽对3 种胆酸盐都有一定的结合能力，其对牛磺胆酸钠的结合率和结合量最高为38.27%和1.32 mg/g，对甘氨胆酸钠的为34.07%和1.04 mg/g，对胆酸钠的最低为20.80%和0.82 mg/g；罗非鱼肉肽添加量为15.0～16.7 mg/mL时，结合胆酸盐的能力较为适宜，模拟胃肠道环境实验中发现罗非鱼肉肽对牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠的结合率和结合量都提高，分别达到43.69%和1.75 mg/g，37.31%和1.49 mg/g，对胆酸钠的结合率和结合量降低为2.46%和0.10 mg/g，罗非鱼肉肽在20 min 对胆酸钠结合率和结合量可达12.93%和0.33 mg/g，60 min 基本达到平衡为28.74%和0.96 mg/g。阳性对照考来烯胺对3 种胆酸盐都有较高的结合率和结合量，对胆酸钠的可达93.10%和3.67mg/g，对牛磺胆酸钠的达97.18%和3.36 mg/g，对甘氨胆酸钠的达94.73%和2.88 mg/g。罗非鱼肉肽结合牛磺胆酸钠的能力约为考来烯胺的40%。结合5 种肽的可溶性蛋白含量可知，水解度会影响鱼蛋白肽结合胆酸盐的能力，但是蛋白种类是更为重要的影响因素，所以进一步开展对罗非鱼肉肽的分级纯化及理化性质的研究很有必要。