曲美他嗪对放射性心脏损伤的保护作用及其机制

(青岛大学附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003)

放射治疗是治疗胸部恶性肿瘤的重要手段之一，但在照射过程中常无法避开心脏位置，其随后引起的放射性心脏损伤(RIHD)会对患者产生严重影响，是导致癌症幸存者死亡的主要原因[1-2]。RIHD可严重影响患者的生存质量和生存期，限制肿瘤靶区的放射剂量，使肿瘤的局部控制率下降，因而对RIHD研究也越来越受到关注[3-4]。研究发现三维放疗，平均心脏剂量每增加1 Gy，9年后心脏事件风险增加16.5%。即使优化后的放射治疗方案和操作技术会一定程度降低RIHD的发病率，但仍不能完全消除其风险[5-6]。目前药物是RIHD预防和治疗的有效方式[7-9]。曲美他嗪是一类调节心肌能量代谢的药物，能够抑制心肌纤维化，使心肌缺血损伤得到较好的恢复[10-11]。目前曲美他嗪对RIHD的影响研究较少。因此，本研究通过观察C57BL6小鼠应用曲美他嗪以后RIHD的保护情况以及心肌组织中结缔组织生长因子(CTGF)、转化生长因子-β1 (TGF-β1)表达的变化，初步探讨曲美他嗪对心肌的保护作用及其机制，旨在为RIHD的防治提供实验理论基础。

1 材料和方法

1.1 动物及分组

SPF级雄性C57BL6小鼠60只，8周龄，体质量18～22 g。将小鼠随机分为A、B、C、D、E、F组，每组10只，在恒温(22±2)℃、湿度(50±10)%及正常光照条件下适应性饲养1周后实验。

1.2 实验材料及试剂

自制小鼠固定板，CLINAC23EX电子直线加速器(美国VARIAN公司)，HispeedNX/I模拟定位机(美国GE公司)，旋涡混合器XW-80A、全自动生化分析仪和加样器(芬兰Labsystems公司)，盐酸曲美他嗪(施维雅(天津)制药有限公司，国药准字 H20055465)，Trizol试剂盒、逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(大连Takara公司)，TGF-β1 Polyclonal Antibody E-AB-70076以及CTGF Polyclonal Antibody E-AB-70032(武汉Elabscience公司)，免疫组化二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，TGF-β1、CTGFmRNA 引物(青岛睿博公司)。

1.3 模型的制备及各组小鼠的处理

空白对照组(A组)小鼠相同条件下饲养，不进行任何干预；模型组(B组)小鼠于实验第2周以6 MV-X线20 Gy单次照射小鼠胸部；照射+照射前低剂量给药组(C组)小鼠从第1天开始每天固定时间以10 mg/kg曲美他嗪灌胃，共9周，并于第2周开始与B组小鼠进行相同照射；照射+照射前高剂量给药组(D组)小鼠从第1天开始每天固定时间以20 mg/kg曲美他嗪灌胃，共9周，并于第2周开始与B组行相同照射；照射+照射后低剂量给药组(E组)先于实验第2周开始与B组行相同照射，并于第 3周开始每天固定时间以10 mg/kg曲美他嗪灌胃，共7周；照射+照射后高剂量给药组(F组)先于实验第2周开始与B组行相同照射，并于第3周开始每天固定时间以20 mg/kg曲美他嗪灌胃，共7周。B组的照射条件及剂量具体为：以40 g/L的水合氯醛(0.01 mL/g)腹腔注射麻醉成功后，将小鼠仰卧位固定于自制固定板上，在模拟机下定位确定照射野的范围(以剑突为中心上下各0.5 cm，两侧开放)，并在体表标记照射野，其余部位均用厚5 cm的铅块遮挡，小鼠在直线加速器下以6 MV-X线20 Gy单次照射，源皮距为100 cm，剂量吸收率为300 cGy/min。实验结束后在深度麻醉下取出各组小鼠心脏。

1.4 指标及其检测方法

小鼠心脏组织以苏木精-伊红(HE)染色后，光学显微镜下观察形态变化。采用免疫组化方法检测小鼠心脏组织中CTGF、TGF-β1蛋白的表达，计算阳性表达率。蛋白阳性表达率的计算方法为：400倍光学显微镜下每张切片随机取10个高倍镜视野进行计数，每个视野取200个细胞，以心脏组织包膜、包浆中出现棕黄色颗粒认为蛋白表达阳性，计算阳性细胞所占的百分比，即为蛋白阳性表达率。荧光定量PCR检测小鼠心脏组织中CTGF、TGF-β1 mRNA表达量。管家基因β-actin(小鼠)上游引物5′-GATTACTGCTCTGGCTCCTAGC-3′，下游引物5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3′；CTGF上游引物5′-CAAGGACCGCACAGCAGTTGG-3′，下游引物5′-CAGGCAGTTGGCTCGCATCATAG-3′；TGF-β1上游引物5′-CGCAACAACGCCATCTA-TGA-3′，下游引物5′-ACTGCTTCCCGAATGTC-TGA-3′。实验步骤按说明书进行。

1.5 统计学处理

2 结 果

除去B、C、E组各死亡1、2、1只小鼠外，最终有56只小鼠纳入实验结果分析。

2.1 各组小鼠心脏组织病理变化结果

光镜下A组小鼠正常心肌纤维呈淡红色、不规则的短圆柱形或短带状，细胞核呈蓝紫色、卵圆形，在心肌间有少量疏松结缔组织、毛细血管丰富，无变性和水肿(图1A)；B组小鼠心肌间质纤维沉积增多，有大量炎细胞浸润(图1B)；C、D组小鼠心肌间质内血管壁增厚，呈现轻度的血管周纤维化，少量炎细胞浸润(图1C、D)；E、F组小鼠心肌间质略有纤维沉积，略有炎细胞浸润(图1E、F)。

A、B、C、D、E、F分别为A、B、C、D、E、F组，HE染色，200倍

2.2 各组小鼠心肌组织中CTGF、TGF-β1蛋白表达情况比较

免疫组化结果显示，心肌组织中细胞包浆、包膜中棕色颗粒增多。单因素方差分析结果显示，多组间CTGF、TGF-β1蛋白阳性表达率比较差异具有显著意义(F=41.819、11.284，P<0.05)。CTGF、TGF-β1蛋白阳性表达率比较，各给药组显著低于B组，C组高于D组，E组高于F组，A组低于其余各组(P<0.05)；但C组与E组、D组与F组比较差异均无显著性(P>0.05)。见表1。

2.3 各组小鼠心肌组织中CTGF、TGF-β1 mRNA水平比较

单因素方差分析结果显示，多组间两种基因表达量比较差异具有统计学意义(F=5.877、18.164,P<0.05)。CTGF、TGF-β1 mRNA表达量，各给药组显著低于B组，C组高于D组，E组均高于F组，A组均低于其余各组(P<0.05)；但C组与E组、D组与F组比较差异无显著性(P>0.05)。见表1。

3 讨 论

RIHD是胸部肿瘤放射治疗时对心脏照射造成的损伤，早期即可引起心脏急性损伤反应，最终导致心肌纤维化，影响患者的生存质量，使患者的病死率增高[12-13]。因此，减少辐射对心脏造成的伤害，有效降低放疗后并发症的发生率，成为放疗界亟待解决的问题[14]。本课题组前期实验结果提示心前区单次大剂量(6 MV-X线20 Gy)照射16周后造成小鼠心脏损伤，发生机制可能与促凋亡蛋白BAX表达增加，抗凋亡蛋白BCL-2表达减少有关[15]。本研究通过将小鼠在直线加速器下以6 MV-X线20 Gy单次照射胸部，8周后观察照射后各组小鼠心肌形态学变化，以评估心肌损伤情况，HE染色结果显示各照射组出现不同程度的心肌间质纤维沉积，有大量炎细胞浸润，其中以B组尤为显著，而各给药组较轻，提示照射后小鼠出现了以炎症、心肌纤维化为表现的RIHD，而曲美他嗪的干预减轻了心脏的损伤。

组别nCTGF蛋白阳性表达(χ/%)TGF-β1蛋白阳性表达(χ/%)CTGFmRNATGF-β1mRNAA组1024.60±4.4520.40±4.691.12±0.331.00±0.16B组958.22±9.2641.11±7.371.79±0.451.64±0.18C组836.00±4.7729.75±5.041.38±0.101.30±0.14D组1026.40±3.3522.90±4.441.20±0.161.16±0.12E组932.22±4.1628.89±3.331.43±0.111.43±0.20F组1027.90±3.9623.50±4.741.21±0.351.26±0.09

研究表明，TGF-β1是与组织纤维化发展最密切相关的因子，是典型的促纤维化细胞因子，在心肌纤维化过程中起至关重要的作用[16-17]。国内外研究提示，多种因素导致TGF-β1表达下调后可抑制心肌纤维化，且在辐射诱导的多器官纤维化中发挥重要作用，大剂量放射后大鼠心肌组织中TGF-β1增加预示了无症状的纤维化[18-20]。本研究通过免疫组化、PCR检测结果显示，与A组相比，照射后各组小鼠心肌组织中TGF-β1表达增加，HE染色结果显示，小鼠心肌间出现炎性细胞浸润、心肌细胞水肿且细胞之间排列紊乱等炎症和纤维化症状，说明照射后小鼠心肌组织中TGF-β1表达增加，与之前的研究结果一致。有研究显示，以阿托伐他汀、葛根素等干预，可减少RIHD动物心肌纤维化的发生[21-23]。周游等[24]研究发现曲美他嗪能够通过减少心肌组织中TNF-α的表达,减轻大鼠放射后心肌组织的损伤。本研究中应用曲美他嗪干预后，小鼠心肌组织中TGF-β1水平降低，HE染色结果显示各给药组心肌的炎症、纤维化程度均较B组减轻，说明曲美他嗪还可通过下调TGF-β1表达而发挥抑制心肌纤维化的作用。

研究显示，心肌纤维化模型小鼠的心肌组织中CTGF蛋白表达水平与心肌重构及纤维化程度呈正相关[25]，心脏病患者的心肌纤维化是由CTGF基因介导TGF-β1信号转导产生的，因此CTGF的异常表达在患者心肌纤维化过程中起着至关重要的作用[26-27]。本研究显示，心脏照射后8周各照射组均出现CTGF蛋白及mRNA表达相较于A组增高的现象，HE染色结果显示小鼠心肌组织纤维化也加重，提示CTGF具有促纤维化的作用。本研究结果还显示，作为评估小鼠放射性心肌纤维化的指标TGF-β1和CTGF，在各组心肌组织中增减趋势一致，与LIPSON等[28]的研究结果一致，提示RIHD小鼠通过曲美他嗪干预后，可能通过阻断CTGF的合成及降低TGF-β1信号介导的胶原合成，逆转心肌纤维化进程。

曲美他嗪是近年来在临床上广泛应用的抗缺血性心肌损伤的药物，可通过降低游离脂肪酸的氧化速率，控制游离脂肪酸/葡萄糖氧化的供能平衡，减少高能磷酸盐生成过程中对氧的需求，维持ATP的产生和缺血心肌细胞的能量代谢及收缩功能，来发挥对心肌的代谢性保护作用[10]。国内外学者研究曲美他嗪对小鼠因不同原因所致心肌损伤的保护作用时，以灌胃的方式设置10 mg/kg与20 mg/kg两种梯度的剂量给药，结果显示曲美他嗪可有效延缓小鼠动脉粥样硬化斑块进展以及预防和治疗小鼠脓毒症引起的心肌功能障碍[29-31]。因此本研究的曲美他嗪给药剂量也设定为10 mg/kg与20 mg/kg，结果显示，X线照射8周后曲美他嗪各剂量组小鼠比B组小鼠心肌细胞损伤减轻，与心肌纤维化相关的两种因子CTGF、TGF-β1表达量也降低，且随曲美他嗪给药剂量增加，小鼠心肌细胞损伤程度减轻。因此，在保护小鼠放射性心肌纤维化作用中，曲美他嗪高剂量组优于低剂量组；而照射前用药与照射后用药的小鼠心肌损伤程度无明显差异，原因可能为在心肌出现供氧不足时，曲美他嗪可提高细胞对氧的利用率，从而产生了足够的ATP，起到了保护心肌的作用，而在小鼠受到照射前提前给予曲美他嗪，因没有缺血缺氧环境，反而发挥不出来曲美他嗪应有的药理作用[32]。

综上所述，小鼠的心脏受到照射后会出现心肌炎症和纤维化症状，致心肌组织CTGF、TGF-β1表达增加，而曲美他嗪可减轻小鼠因照射引起的心肌损伤，其机制可能与CTGF、TGF-β1表达降低有关，但是具体的信号通路还需更深入的研究探讨。本实验数据和结论可为RIHD心肌保护的基础研究提供参考。