新型纳米材料石墨烯量子点对膀胱癌T24细胞作用的研究

(青岛大学附属医院泌尿外科，山东 青岛 266003)

世界范围人群中膀胱肿瘤发病率居第9位，死亡率居第13位[1-2]。在我国膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，男性发病率高于女性，其发病率和死亡率均居泌尿系统肿瘤首位[3-4]。非肌层浸润性膀胱尿路上皮癌治疗上主要采用手术后进行膀胱局部灌注化疗，但即使进行积极的、规范的治疗，最终仍然有10%～15%患者会进展为肌层浸润性膀胱癌[5-6]。石墨烯量子点(GQD)是石墨烯的衍生物，属于碳纳米颗粒的一种准零维材料，具有很多异于宏观材料的特殊结构和光学性质[7]。广泛应用于生物成像、肿瘤定位及诊断、基因载体、光动力学治疗以及细胞标记等[8-10]。光动力学疗法(PDT)的原理是利用肿瘤细胞可以选择性吸收和潴留光敏剂材料，在特定波长的激发光作用下，光敏剂从低能量的基态跃进到高能量的激发态，返回基态时产生活性氧类自由基(ROS)，ROS具有细胞毒性作用，可以

杀死肿瘤细胞[11]。本实验通过GQD介导的PDT体外条件下对人膀胱癌T24细胞的作用和可能机制进行初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料来源

GQD由上海大学纳米生物研究所提供，具体制备方法见相关文献[12]。人膀胱癌T24细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞所。

1.2 试剂

Cell Counting Kit-8 (CCK-8)试剂盒购买于碧云天生物科技公司；DAPI试剂盒、培养基RPMI 1640、胎牛血清购买于美国Invitrogen公司。

1.3 GQD介导的PDT对T24细胞的作用

将膀胱癌T24细胞以108/L的密度接种于96孔细胞培养板中，培养至对数生长期以后，将细胞分为6组，分别为细胞对照组(A组)、20 mg/L GQD对照组(B组)、1 J/cm2激光对照组(C组)、5 mg/L GQD+1 J/cm2激光处理组(D组)、10 mg/L GQD+1 J/cm2激光处理组(E组)以及20 mg/L GQD+1 J/cm2激光处理组(F组)，每组设4个复孔。B、D、E、F组加入相应浓度GQD共同孵育2 h后，C、D、E、F组使用532 nm波长、能量密度为1 J/cm2的激光照射后再培养12 h。

1.4 CCK-8法检测T24细胞的存活情况

按照CCK-8试剂盒说明书的要求，所有实验组每孔加入CCK-8溶液10 μL，继续培养1 h后，采用酶联免疫检测仪于波长490 nm处检测各孔的吸光度值，计算相对抑制率[11]。

1.5 激光共聚焦显微镜(CLSM)观察GQD在T24细胞内的分布

膀胱癌T24细胞按照5×107/L的密度接种于CLSM专用的24孔培养板中，培养24 h以后，再加入10 mg/L的GQD溶液10 μL培养1 h，PBS洗3次。再加入2 mg/L的DAPI溶液染色10 min，PBS洗3次后，CLSM采用双通道激发光激发，激光波长均为405 nm，观察DAPI和GQD发出的荧光在细胞内的分布情况。

1.6 统计学方法

2 结 果

2.1 各组T24细胞存活情况比较

CCK-8法检测结果显示，A、B、C、D、E、F组吸光度值分别为0.834±0.067、0.793±0.053、0.830±0.070、0.768±0.044、0.504±0.025、0.217±0.186，各组细胞的吸光度值比较差异具有显著意义(F=30.060，P<0.05)，其中A、B、C、D组间比较，差异无显著性(P>0.05)，E组与A、B、C、D组间比较，差异均有显著性(P<0.05)，F组与A、B、C、D、E组间比较，差异均有显著性(P<0.05)。在532 nm激光照射下，能量密度为1 J/cm2时，经PDT处理后的D、E、F组细胞生长的相对抑制率分别为7.84%、39.61%和74.37%，随着GQDS浓度的增加，对T24细胞的生长抑制率也逐渐升高。

2.2 CLSM观察GQD在膀胱癌T24细胞内的定位情况

CLSM观察显示DAPI进入T24细胞后定位于细胞核内，使用405 nm激光激发后发出蓝色荧光(图1A)；GQD进入T24细胞后，在405 nm激光激发后发出绿色荧光(图1B)；通过软件融合图1A和图1B后得到融合图像(图1C)，显示GQD发出的绿色荧光与DAPI发出的蓝色荧光重合良好。

3 讨 论

研究显示，PDT可以利用肿瘤细胞特异性吸收光敏剂，然后在相应波长的激发光照射下，处于基态的光敏剂会跃进到高能量的激发态，而激发态的光敏剂是不稳定的，在返回基态的过程中将电子传递给氧气而产生ROS，而ROS可以破坏线粒体、细胞核等导致肿瘤细胞死亡[5]。早在20世纪初科学家们就发现吖啶在可见光照射后对单细胞生物具有致死作用[13-14]。2003年中国SFDA正式批准PDT的临床应用，目前研究证实许多癌前病变、表浅肿瘤、早期肿瘤经PDT治疗后都取得一定疗效[15-16]。

A：DAPI进入T24细胞后显示蓝色荧光；B：GQD进入T24细胞后显示绿色荧光；C：A、B融合后图像，400倍

通过细胞核的光学成像技术，可以深入了解细胞恶性转化过程，获得肿瘤诊断的关键信息，实时监测肿瘤的治疗进程以及开发新的抗癌药物[12]。近年来，具有高荧光特性的GQD凭借其优异的光学性能、低毒性和独特的表面结构特性[17]，在生物成像、肿瘤定位和诊断方面具有广泛的应用[18-19]。但是常规的GQD在实际应用过程中仍有一些不足之处[20]：①为了有效地对细胞核进行成像，需要耦联价格昂贵的核定位肽；②耦联核定位肽的GQD同时内化于胞质和细胞核内，导致特异性较低；③功能化的GQD无法通过核膜和核仁等结构。本课题所使用新型纳米材料GQD克服了以上缺点[12]，能够溶于水和有机溶剂，同时可对细胞核靶向定位，而且在相应激光照射下可以发出高强度的荧光。

本实验通过采用CCK-8方法检测GQD介导的PDT对膀胱癌T24细胞的作用情况。结果显示B组、C组与A组间膀胱癌T24细胞存活情况差异无显著性，说明单纯的GQD或单纯的激光照射对T24细胞没有杀伤作用；PDT处理组D组与A、B、C组间T24细胞存活情况差异无显著性，而在增加GQD浓度后，E、F与A、B、C、D组间T24细胞存活情况差异有显著性，且E组与F组间T24细胞存活情况差异也具有显著性，说明GQD介导的PDT对T24细胞有明确的杀伤作用，且随着药物浓度的升高，杀伤作用也增加。本研究将T24细胞与GQD孵育后，再加入DAPI染色显示T24细胞的细胞核。根据GQD的光学特性选择波长405 nm激光进行激发，CLSM下观察到GQD在T24细胞内所发出的绿色荧光与DAPI所发出的蓝色荧光是基本重合的，由此说明GQD进入T24细胞后主要定位于细胞核内，具有亲细胞核靶向性。在激光照射下，GQD直接作用并破坏T24细胞的细胞核从而导致细胞死亡，推测这是GQD介导的PDT杀伤T24细胞的可能机制之一。

总之，本实验结果显示，GQD介导的PDT体外对膀胱癌T24细胞有明确的杀伤作用，推测其作用机制可能为GQD进入细胞后定位并作用于细胞核，进而导致肿瘤细胞死亡。但其确切的作用机制及在体内对肿瘤的杀伤作用需进一步的研究。