HPLC法测定18种菊科植物中总黄酮醇苷含量研究

吴小可，张玉佩，王 秀，吴 楠，王卫东，梅丽娟，陶燕铎，杨小兵，于瑞涛*

(1.中国科学院藏药研究重点实验室 青海省藏药研究重点实验室，中国科学院西北高原生物研究所，青海 西宁 810008；2. 中国科学院大学，北京 100049；3. 东莞金美济药业有限公司，广东 东莞 523000)

菊科约1000属，25000～30000种，主要分布于温带地区，是被子植物第一大科，也是植物界演化地位最高的科。我国的菊科植物约有230属，2323种，全国各地均有分布。菊科植物最大的经济价值为药用，我国药用菊科植物有155属，778种[1-2]，属数和种数分别占我国菊科植物总数的67.39%和33.49%。其中，蒿属68种，风毛菊属53种，橐吾属35种，紫菀属34种，香青属18种，蟹甲草属16种，垂头菊属13种[3]。菊科主要化学成分有多糖类、生物碱类、甙类、黄酮类、香豆素类、萜类等。黄酮类化合物是广泛存在于自然界中的一类化合物，种类众多，其生理生化活性多种多样，大多具有扩张冠状血管、降血脂、止血、雌激素样作用、抗抑郁、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性[4-7]。查阅文献发现，使用HPLC法测定总黄酮醇苷含量的方法多应用于银杏及其提取物或成药，对菊科植物总黄酮醇苷含量进行测定未见报道[8-14]。本研究采用HPLC法对青海产18种菊科植物进行总黄酮醇苷的含量进行分析，以期为菊科植物的进一步研究开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

本研究选取的18种菊科植物分别为：牛蒡子、绢毛菊、掌叶橐吾、蛛毛蟹甲草、臭蒿、垂头菊、黄帚橐吾、美丽风毛菊、水母雪莲、多花亚菊、川西小黄菊、冷蒿、箭叶橐吾、柔软紫菀、乳白香青、狗娃花、珠光香青、紫菀木。

1.1.2 试剂

槲皮素(批号117395)对照品(如吉生物科技，含量>98%)、山柰素(批号 1108612200606)对照品(中国药品生物制品检定所，含量>98%)、异鼠李素(批号1108612200407)对照品(中国药品生物制品检定所，含量>98%)，HCl含量36%～38%盐酸(甘肃省盐锅峡化工总厂)，分析纯甲醇(天津市凯通化学试剂有限公司)，色谱用超纯水(优普超纯水机自制)，色谱甲醇、甲酸(天津康科德科技公司) 。

1.2 仪器与设备

FZ102型微型植物试样粉碎机(北京市永光明医疗仪器厂)，FA1204电子分析天平(力辰科技宁波市郑州华丰电子仪器厂)，KQ5200E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，优普超纯水机(四川成都超纯科技有限公司)，恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)，Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)。

1.3实验方法

1.3.1 色谱条件

1.3.2 样品溶液制备

1.3.2.1 甲醇-25%盐酸溶液(4∶1)混合溶液制备 HCl含量36%～38%的盐酸溶液与纯水按照7∶3进行混合，配置成HCl含量25%的盐酸溶液。HCl含量25%的盐酸溶液与甲醇按照1∶4进行混合，配置成甲醇-25% 盐酸溶液(4∶1)混合溶液。

1.3.2.2 样品溶液制备 将药用植物用粉碎机进行粉碎。称取植物粉末1 g，置于250 mL平底烧瓶中，加入甲醇-25%盐酸溶液(4∶1)混合溶液50 mL。80℃水浴回流1 h，静置至室温。用注射器吸取，0.45 μm微孔滤膜过滤至液相小瓶，HPLC测定。

1.3.3 对照品溶液制备

1.3.3.1 槲皮素单标标准液制备 精确称取槲皮素10.6 mg，于烧杯中用少量甲醇溶解，转移至50 mL容量瓶，用少量甲醇洗涤烧杯数次，转移洗涤液至容量瓶，用甲醇定容至刻度，配置成212 μg/mL单标标准液。于4℃冰箱保存。

图1 对照品与样品的HPLC分析色谱图Fig. 1 HPLC chromatogram of reference and sample注：A 对照品(Reference substance);B 紫菀木样品(Asterothamnus alyssoides (Turcz.) Novopokr.);1 槲皮素(Quercetin)；2 山柰素(Kaempferol)；3 异鼠李素(Kaempferol)

1.3.3.2 山柰素单标标准液制备 精确称取山柰素10.6 mg，于烧杯中用少量甲醇溶解，转移至50 mL容量瓶，用少量甲醇洗涤烧杯数次，转移洗涤液至容量瓶，用甲醇定容至刻度。存在少量未溶沉淀，超声5 min使其溶解。配置成212 μg/mL单标标准液。于4℃冰箱保存。

1.3.3.3 异鼠李素单标标准液制备 精确称取槲皮素9.3 mg，于烧杯中用少量甲醇溶解，转移至50 mL容量瓶，用少量甲醇洗涤烧杯数次，转移洗涤液至容量瓶，用甲醇定容至刻度。存在少量未溶沉淀，超声5 min使其溶解。配置成186 μg/mL单标标准液。于4℃冰箱保存。

水解大麦蛋白具乳化能力，有抗氧性能，适合用作护肤调理性原料；也用于护发制品，在洗发烫发卷发剂等中作护理剂。

1.3.3.4 混标标准液制备 分别用移液枪吸取三种单标标准液5 mL转移至另一50 mL容量瓶，甲醇定容至刻度，配置成混标标准液，槲皮素、山柰素、异鼠李素浓度分别为21.2 μg/mL、21.2 μg/mL、18.6 μg/mL。于4℃冰箱保存。

1.3.4 线性关系考察

将槲皮素、山柰素、异鼠李素单标标准液分别稀释为1、2.5、5、10、20、200倍，HPLC测定，分别以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得到回归方程。

1.3.5 精密度试验

将混标标准液用移液枪吸取1 mL至液相小瓶，平行6次，HPLC测定。

1.3.6 稳定性试验

称取植物粉末1 g，置于250 mL平底烧瓶中，加入甲醇-25%盐酸溶液(4∶1)混合溶液50 mL。80℃水浴回流1 h，静置至室温。用注射器吸取，有机滤膜过滤至液相小瓶，分别于0、2、4、6、8、10、12 h时HPLC测定。

1.3.7 重复性试验

平行6次，称取植物粉末1 g，置于250 mL平底烧瓶中，加入甲醇-25%盐酸溶液(4∶1)混合溶液50 mL。80℃水浴回流1 h，静置至室温。用注射器吸取，有机滤膜过滤至液相小瓶，HPLC测定。

1.3.8 样品含量测定

将药用植物用粉碎机进行粉碎。称取植物粉末1 g，置于250 mL平底烧瓶中，加入甲醇-25%盐酸溶液(4∶1)混合溶液50 mL。80℃水浴回流1 h，静置至室温。用注射器吸取，有机滤膜过滤至液相小瓶，HPLC测定。

2 结果与分析

2.1 线性关系结果

结果如表1，槲皮素、山柰素和异鼠李素的浓度分别在线性范围1.06～212 μg/mL、1.06～212 μg/mL和0.93～186 μg/mL内与峰面积呈良好的线性关系。

表1 线性关系考察结果(n=6)

2.2 精密度结果

结果如表2，槲皮素、山柰素、异鼠李素峰面积的RSD分别为1.05%、1. 06%、0. 91%，表明本方法精密度良好。

2.3 稳定性结果

结果如表3，槲皮素、山柰素、异鼠李素的RSD分别为0.75%、0.84%、0.33%，表明样品溶液在12 h内稳定性良好。

2.4 重复性结果

总黄酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+异鼠李素含量)×2.51，结果如表4，计算得总黄酮醇苷平均含量为1.23%，RSD为1.86%，表明本方法重复性良好。

表2 精密度试验测定结果(n=6)

表3 稳定性试验测定结果(n=7)

表4 重复性试验测定结果(n=6)

2.5 样品含量结果

总黄酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰素含量+异鼠李素含量)×2.51，计算总黄酮醇苷品均含量，结果如表5。所测18种菊科植物中，总黄酮醇苷含量在0.1278～12.1721 mg/g之间，从小到大依次为牛蒡子、绢毛菊、掌叶橐吾、蛛毛蟹甲草、臭蒿、垂头菊、黄帚橐吾、美丽风毛菊、水母雪莲、多花亚菊、川西小黄菊、冷蒿、箭叶橐吾、柔软紫菀、乳白香青、狗娃花、珠光香青、紫菀木。

表5 样品总黄酮醇苷含量测定结果

3 结论与讨论

本实验考察了不同流动相和洗脱时间条件下的出峰效果，结果表明，采用流动相甲醇-0.2%甲酸溶液(48∶52)，洗脱时间40 min，各峰峰形完整无拖尾，分离效果好。3种黄酮醇苷在紫外360 nm处有较强紫外吸收，因此确定HPLC检测波长360 nm[15]。甲醇-25%盐酸溶液(4∶1)混合溶液作用下，供试品中的黄酮类化合物充分水解为黄酮苷元[16]。水浴加热80℃，回流1 h的方法，能有效提高黄酮醇苷的提取率，回流时间过长会导致部分黄酮苷元分解从而降低提取率[17-19]。综合考虑，提取方法最终确定为，甲醇-25%盐酸溶液(4∶1)混合溶液，水浴加热80℃，回流1 h。检测条件选取，HPLC检测波长360 nm，流动相甲醇-0.2%甲酸溶液(48∶52)，洗脱时间40 min。

所测18种菊科植物进行不同属之间的对比可知，紫菀木属、香青属、狗娃花属、紫菀属等植物总黄酮醇苷含量较高，可作为总黄酮醇苷类化合物提取分离纯化的来源；而牛蒡属、菊苣属、蟹甲草属等植物中含量较低，建议开发其他应用价值。另外，在同属不同种植物之间进行对比，蒿属中，冷蒿含量高于臭蒿；橐吾属中，箭叶橐吾含量高于黄帚橐吾，黄帚橐吾含量高于掌叶橐吾；香青属中，珠光香青高于乳白香青，同属植物之间总黄酮醇苷含量相差较大，不具有分类学上的统一性。

本研究以槲皮素、山柰素和异鼠李素为对照品，应用高效液相色谱法，测定青海产多种菊科植物的总黄酮醇苷含量。该方法准确稳定，重复性好，可用于菊科植物的质量控制，也可为更深入地研究菊科植物、开发其应用价值奠定理论基础。